Alzheimer hastalığı (AD), altta yatan çoklu patofizyolojisini yansıtan protein biyobelirteçlerinden yoksundur ve tanı ve tedavinin ilerlemesini engellemektedir. Burada, AD patofizyolojisinin geniş bir aralığını temsil eden beyin omurilik sıvısı (BOS) biyobelirteçlerini tanımlamak için kapsamlı proteomik kullanıyoruz. Multipleks kütle spektrometresi, AD CSF'de ve beyinde sırasıyla yaklaşık 3.500 ve yaklaşık 12.000 protein tanımladı. Beyin proteomunun ağ analizi, 15'i beyin omurilik sıvısı proteomu ile örtüşen 44 biyolojik çeşitlilik modülünü çözdü. Bu örtüşen modüllerdeki CSF AD belirteçleri, farklı patofizyolojik süreçleri temsil eden beş protein grubuna katlanır. AD'li beyindeki sinapslar ve metabolitler azalır, ancak BOS artar, beyin ve BOS'taki gliyal açısından zengin miyelinasyon ve bağışıklık grupları artar. Panel değişikliklerinin tutarlılığı ve hastalık özgüllüğü 500'den fazla ek CSF örneğinde doğrulandı. Bu gruplar aynı zamanda asemptomatik AD'de biyolojik alt grupları da tanımladı. Genel olarak bu sonuçlar, AD'deki klinik uygulamalar için web tabanlı biyobelirteç araçlarına doğru umut verici bir adımdır.
Alzheimer hastalığı (AH), dünya çapında nörodejeneratif demansın en yaygın nedenidir ve sinaptik iletim, glial aracılı bağışıklık ve mitokondriyal metabolizma dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik sistem işlev bozuklukları ile karakterize edilir (1-3). Bununla birlikte, yerleşik protein biyobelirteçleri hala amiloid ve tau proteinini tespit etmeye odaklanmaktadır ve bu nedenle bu farklı patofizyolojiyi yansıtamamaktadır. Beyin omurilik sıvısında (BOS) en güvenilir şekilde ölçülen bu "çekirdek" protein biyobelirteçleri arasında (i) kortikal amiloid plakların oluşumunu yansıtan amiloid beta peptid 1-42 (Aβ1-42); (ii) toplam tau, akson dejenerasyonunun bir işareti; (iii) fosfo-tau (p-tau), patolojik tau hiperfosforilasyonunun bir temsilcisi (4-7). Bu beyin omurilik sıvısı biyobelirteçleri, "belirgin" AD protein hastalıklarını (4-7) tespit etmemizi büyük ölçüde kolaylaştırmış olsa da, hastalığın ardındaki karmaşık biyolojinin yalnızca küçük bir bölümünü temsil ederler.
AD biyobelirteçlerinin patofizyolojik çeşitliliğinin olmayışı, (i) AD hastalarının biyolojik heterojenitesini tanımlayamama ve ölçememe, (ii) özellikle klinik öncesi aşamada hastalık şiddeti ve ilerlemesinin yetersiz ölçümü ve (ii) dahil olmak üzere birçok zorluğa yol açmıştır. iii) nörolojik bozulmanın tüm yönlerini tamamen çözemeyen terapötik ilaçların geliştirilmesi. İlgili hastalıklardan AD'yi tanımlamak için dönüm noktası niteliğindeki patolojiye güvenmemiz, yalnızca bu sorunları daha da kötüleştiriyor. Giderek daha fazla kanıt, demansı olan yaşlı kişilerin çoğunun bilişsel gerilemenin birden fazla patolojik özelliğine sahip olduğunu göstermektedir (8). AD patolojisi olan kişilerin %90 veya daha fazlasında aynı zamanda vasküler hastalık, TDP-43 kapanımları veya diğer dejeneratif hastalıklar da mevcuttur (9). Bu yüksek orandaki patolojik örtüşmeler demans için mevcut tanısal çerçevemizi bozmuştur ve hastalığın daha kapsamlı bir patofizyolojik tanımına ihtiyaç vardır.
Çeşitli AD biyobelirteçlerine acil ihtiyaç göz önüne alındığında, alan, biyobelirteçleri keşfetmeye yönelik genel sistemi temel alan "omik" yöntemini giderek daha fazla benimsiyor. Hızlandırılmış İlaç Ortaklığı (AMP)-AD İttifakı 2014 yılında başlatıldı ve programın ön sıralarında yer alıyor. Ulusal Sağlık Enstitüleri, akademi ve endüstri tarafından yürütülen bu multidisipliner çalışma, AH'nin patofizyolojisini daha iyi tanımlamak ve biyolojik çeşitlilik teşhis analizi ve tedavi stratejileri geliştirmek için sistem tabanlı stratejiler kullanmayı amaçlamaktadır (10). Bu projenin bir parçası olarak ağ proteomikleri, AD'de sistem tabanlı biyobelirteçlerin geliştirilmesi için umut verici bir araç haline geldi. Bu tarafsız veriye dayalı yaklaşım, karmaşık proteomik veri setlerini, spesifik hücre tipleri, organeller ve biyolojik fonksiyonlarla ilişkili, birlikte eksprese edilen proteinlerin grupları veya "modülleri" halinde düzenler (11-13). AD'li beyin üzerinde neredeyse 12 adet bilgi açısından zengin ağ proteomik çalışması yapılmıştır (13-23). Genel olarak, bu analizler AD beyin ağı proteomunun bağımsız kohortlarda ve çoklu kortikal bölgelerde yüksek oranda korunmuş modüler bir organizasyonu koruduğunu göstermektedir. Ek olarak, bu modüllerden bazıları veri kümeleri genelinde AD ile ilişkili bollukta tekrarlanabilir değişiklikler göstererek, birden fazla hastalığın patofizyolojisini yansıtır. Toplu olarak bu bulgular, Alzheimer'da sistem bazlı bir biyobelirteç olarak beyin ağı proteomunun keşfi için umut verici bir dayanak noktası olduğunu göstermektedir.
AD beyin ağı proteomunu klinik açıdan yararlı sistem bazlı biyobelirteçlere dönüştürmek için beyinden türetilen ağı AD CSF'nin proteomik analiziyle birleştirdik. Bu entegre yaklaşım, sinapslar, kan damarları, miyelinasyon, iltihaplanma ve metabolik yolların işlev bozukluğu dahil olmak üzere çok çeşitli beyin temelli patofizyolojiyle ilişkili, ümit verici beş BOS biyobelirteç grubunun tanımlanmasına yol açtı. Bu biyobelirteç panellerini, çeşitli nörodejeneratif hastalıklardan alınan 500'den fazla BOS örneği dahil olmak üzere çoklu replikasyon analizleri yoluyla başarıyla doğruladık. Bu doğrulama analizleri, asemptomatik AD'li (AsymAD) hastaların BOS'undaki grup hedeflerinin incelenmesini veya normal bir bilişsel ortamda anormal amiloid birikimine dair kanıtların gösterilmesini içerir. Bu analizler, AsymAD popülasyonundaki önemli biyolojik heterojenliği vurguluyor ve hastalığın en erken aşamalarında bireyleri alt tiplere ayırabilecek panel belirteçlerini tanımlıyor. Genel olarak bu sonuçlar, AD'nin karşılaştığı klinik zorlukların çoğunu başarıyla çözebilecek çoklu sistemlere dayanan protein biyobelirteç araçlarının geliştirilmesinde önemli bir adımı temsil ediyor.
Bu çalışmanın temel amacı AD'ye yol açan çeşitli beyin temelli patofizyolojiyi yansıtan yeni beyin omurilik sıvısı biyobelirteçlerini tanımlamaktır. Şekil S1, (i) AD CSF'nin ön bulguları ve ağ beyin proteomunun beyinle ilişkili çoklu BOS hastalığı biyobelirteçlerini tanımlamak için yönlendirilen kapsamlı bir analizi ve (ii) sonraki replikasyonu içeren araştırma metodolojimizi özetlemektedir. akışkan gruplar. Keşif odaklı araştırma, Emory Goizueta Alzheimer Hastalığı Araştırma Merkezi'nde (ADRC) 20 bilişsel açıdan normal bireyde ve 20 AD hastasında BOS'un diferansiyel ifadesinin analiziyle başladı. AD tanısı, beyin omurilik sıvısında düşük Aβ1-42 ve yüksek total tau ve p-tau düzeyleri varlığında önemli bir bilişsel bozukluk olarak tanımlanır [Ortalama Montreal Bilişsel Değerlendirme (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tablo S1A). Kontrol (ortalama MoCA, 26,7 ± 2,2) normal seviyelerde BOS biyobelirteçlerine sahipti.
İnsan BOS'u, protein bolluğunun dinamik aralığı ile karakterize edilir; albümin ve diğer aşırı bol miktardaki proteinler, ilgilenilen proteinlerin saptanmasını önleyebilir (24). Protein keşfinin derinliğini arttırmak için, kütle spektrometresi (MS) analizinden önce her bir CSF örneğinden ilk 14 yüksek oranda proteini çıkardık (24). MS tarafından toplam 39.805 peptid tanımlandı ve bunlar 40 örnekte 3691 proteomla eşlendi. Protein ölçümü çoklu tandem kütle etiketi (TMT) etiketlemesi ile gerçekleştirilir (18, 25). Eksik verileri çözmek için sonraki analize yalnızca örneklerin en az %50'sinde miktarı belirlenen proteinleri dahil ettik ve böylece son olarak 2875 proteomun miktarını belirledik. Toplam protein bolluğu seviyelerindeki önemli farklılık nedeniyle, bir kontrol numunesi istatistiksel olarak aykırı değer olarak kabul edildi (13) ve sonraki analize dahil edilmedi. Geriye kalan 39 örneğin bolluk değerleri yaş, cinsiyet ve parti kovaryansına göre ayarlandı (13-15, 17, 18, 20, 26).
Regresyon veri setindeki diferansiyel ifadeyi değerlendirmek için istatistiksel t-test analizini kullanan bu analiz, kontrol ve AD vakaları arasında bolluk seviyeleri önemli ölçüde değişen (P <0.05) proteinleri tanımladı (Tablo S2A). Şekil 1A'da gösterildiği gibi AD'de toplam 225 proteinin bolluğu önemli ölçüde azaldı ve 303 proteinin bolluğu önemli ölçüde arttı. Bu diferansiyel olarak eksprese edilen proteinler, mikrotübülle ilişkili protein tau (MAPT; P = 3,52 x 10−8), nörofilament (NEFL; P = 6,56 x 10−3), büyüme ile ilişkili Protein 43 gibi önceden tanımlanmış birkaç beyin omurilik sıvısı AD işaretleyicisini içerir. (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Yağ Asidi Bağlayıcı Protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Kitinaz 3 benzeri 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Nöral Granülin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) ve VGF sinir büyüme faktörü (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Bununla birlikte, GDP ayrışma inhibitörü 1 (GDI1; P = 1,54 x 10-10) ve SPARC ile ilişkili modüler kalsiyum bağlama 1 (SMOC1; P = 6,93 x 10-9) gibi diğer çok önemli hedefleri de belirledik. Önemli ölçüde azaltılmış 225 proteinin Gen Ontolojisi (GO) analizi, steroid metabolizması, kan pıhtılaşması ve hormon aktivitesi gibi vücut sıvısı süreçleriyle yakın bağlantıları ortaya çıkardı (Şekil 1B ve Tablo S2B). Buna karşılık, önemli ölçüde artan 303 proteini hücre yapısı ve enerji metabolizması ile yakından ilişkilidir.
(A) Volkan grafiği, kontrol (CT) ve kontrol (CT) arasındaki diferansiyel ifadeyi tespit etmek için kullanılan t-testi tarafından elde edilen -log10 istatistiksel P değerine (y-ekseni) göre log2 kat değişimini (x ekseni) gösterir. Tüm proteinlerin BOS proteomunun AD vakaları. AD'de seviyeleri önemli ölçüde azalmış (P <0.05) proteinler mavi renkle gösterilirken, hastalıkta seviyeleri önemli ölçüde artan proteinler kırmızıyla gösterilmiştir. Seçilen protein etiketlenir. (B) Proteinle ilgili en iyi GO terimleri AD'de önemli ölçüde azalır (mavi) ve artar (kırmızı). Biyolojik süreçler, moleküler işlevler ve hücresel bileşenler alanlarında en yüksek z puanlarına sahip üç GO terimini gösterir. (C) MS, BOS örneğinde (solda) MAPT düzeyini ve bunun örnek ELISA tau düzeyiyle (sağda) korelasyonunu ölçtü. İlgili P değeriyle Pearson korelasyon katsayısı görüntülenir. Bir AD vakası için ELISA verilerinin bulunmamasından dolayı bu rakamlar, analiz edilen 39 vakanın 38'ine ait değerleri içermektedir. (D) Kontrolde denetimli küme analizi (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) P <0,01'e ayarlı) ve AD CSF, veri setindeki en önemli ölçüde değiştirilmiş 65 proteini kullanan örnekleri buldu. Standartlaştırın, normalleştirin.
MAPT'nin proteomik seviyesi, bağımsız olarak ölçülen ELISA tau seviyesiyle yakından ilişkilidir (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Şekil 1C), MS ölçümümüzün geçerliliğini destekler. Amiloid öncü protein (APP) seviyesindeki trypsin sindiriminden sonra, Aβ1-40 ve Aβ1-42'nin C terminaline eşlenen izoforma özgü peptitler verimli bir şekilde iyonize edilemez (27, 28). Dolayısıyla belirlediğimiz APP peptidlerinin ELISA Aβ1-42 seviyeleriyle hiçbir ilgisi yoktur. Her vakanın diferansiyel ifadesini değerlendirmek için, numunelerin denetimli bir küme analizini gerçekleştirmek için P <0.0001 [yanlış keşif oranı (FDR) düzeltilmiş P <0.01] ile diferansiyel olarak eksprese edilmiş proteinler kullandık (Tablo S2A). Şekil 1D'de gösterildiği gibi, bu 65 oldukça önemli protein, kontrol benzeri özelliklere sahip bir AD vakası dışında, numuneleri hastalık durumuna göre doğru şekilde kümeleyebilir. Bu 65 proteinden 63'ü AD'de artış gösterirken yalnızca ikisi (CD74 ve ISLR) azaldı. Toplamda, bu beyin omurilik sıvısı analizleri AD'de hastalık biyobelirteçleri olarak hizmet edebilecek yüzlerce proteini tanımlamıştır.
Daha sonra AD beyin proteomunun bağımsız bir ağ analizini gerçekleştirdik. Bu keşfin beyin grubu, kontrol (n = 10), Parkinson hastalığı (PD; n = 10), karma AD/PD (n = 10) ve AD (n = 10) vakalarından dorsolateral prefrontal korteksi (DLPFC) içeriyordu. ) Örnek. Emery Goizueta ADRC. Bu 40 olgunun demografik özellikleri daha önce tanımlanmış (25) ve Tablo S1B'de özetlenmiştir. Bu 40 beyin dokusunu ve 27 vakanın replikasyon grubunu analiz etmek için TMT-MS'yi kullandık. Toplamda bu iki beyin veri seti, 12.943 proteomla eşlenen 227.121 benzersiz peptid üretti (25). Sonraki araştırmalara yalnızca vakaların en az %50'sinde miktarı belirlenen proteinler dahil edildi. Nihai keşif veri seti 8817 ölçülmüş protein içerir. Yaş, cinsiyet ve ölüm sonrası aralığa (PMI) göre protein bolluğu düzeylerini ayarlayın. Regresyondan sonra veri setinin diferansiyel ekspresyon analizi, iki veya daha fazla hastalık kohortunda >2000 protein seviyelerinin önemli ölçüde değiştiğini [P <0.05, varyans analizi (ANOVA)] gösterdi. Daha sonra, diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlere ve AD/kontrol ve/veya AD/PD karşılaştırmalarında P <0.0001'e dayalı olarak denetimli bir küme analizi gerçekleştirdik (Şekil S2, A ve B, Tablo S2C). Bu 165 yüksek oranda değiştirilmiş protein, kontrol ve PD örneklerinden AD patolojisi olan vakaları açıkça tasvir ederek, tüm proteomdaki güçlü AD'ye özgü değişiklikleri doğrular.
Daha sonra, veri setini benzer ifade modellerine sahip protein modülleri halinde düzenleyen, keşfedilen beyin proteomu üzerinde ağ analizi gerçekleştirmek için Ağırlıklı Gen Ortak İfade Ağı Analizi (WGCNA) adı verilen bir algoritma kullandık (11-13). Analiz, en büyüğünden (M1, n = 1821 protein) en küçüğüne (M44, n = 34 protein) kadar sıralanmış ve numaralandırılmış 44 modül (M) birlikte eksprese edilen protein tanımladı (Şekil 2A ve Tablo S2D). Yukarıda belirtildiği gibi (13) Her modülün temsili ekspresyon profilini veya karakteristik proteinini hesaplayın ve bunu hastalık durumu ve AD patolojisi ile ilişkilendirin, yani Alzheimer Hastalığı Kayıt Defteri (CERAD) ve Braak Skorunun ittifakını kurun (Şekil 2B). Genel olarak, 17 modül AD nöropatolojisiyle anlamlı düzeyde ilişkiliydi (P <0.05). Bu hastalıkla ilgili modüllerin çoğu hücre tipine özgü belirteçler açısından da zengindir (Şekil 2B). Yukarıda belirtildiği gibi (13), hücre tipi zenginleşmesi, modül örtüşmesinin ve hücre tipine özgü genlerin referans listesinin analiz edilmesiyle belirlenir. Bu genler, izole edilmiş fare nöronları, endotelyal ve glial hücrelerdeki yayınlanmış verilerden türetilmiştir. RNA dizileme (RNA-seq) deneyi (29).
(A) Beyin proteomunun WGCNA'sını keşfedin. (B) Modüler imza proteininin (modüler protein ekspresyonunun ilk ana bileşeni) CERAD (Aβ plak) ve Braak (tau dolaşma) puanları dahil olmak üzere AD nöropatolojik özelliklerine (üstte) sahip çift ağırlıklı orta korelasyon (BiCor) analizi. Pozitif (kırmızı) ve negatif (mavi) korelasyonların yoğunlukları iki renkli bir ısı haritasıyla gösterilir ve yıldız işaretleri istatistiksel önemi gösterir (P <0.05). Her protein modülünün hücre tipi ilişkisini değerlendirmek için Hipergeometrik Fisher'ın Kesin Testini (FET) (altta) kullanın. Kırmızı gölgelemenin yoğunluğu hücre tipi zenginleşme derecesini gösterir ve yıldız işareti istatistiksel önemi gösterir (P <0.05). FET'ten türetilen P değerini düzeltmek için BH yöntemini kullanın. (C) Modüler proteinlerin GO analizi. En yakından ilişkili biyolojik süreçler her modül veya ilgili modül grubu için gösterilmektedir. oligo, oligodendrosit.
Yakından ilişkili beş astrosit ve mikroglia açısından zengin modülden oluşan bir dizi (M30, M29, M18, M24 ve M5), AD nöropatolojisiyle güçlü bir pozitif korelasyon gösterdi (Şekil 2B). Ontoloji analizi bu glial modülleri hücre büyümesi, çoğalması ve bağışıklık ile ilişkilendirir (Şekil 2C ve Tablo S2E). İki ek glial modül, M8 ve M22 de hastalıkta güçlü bir şekilde yukarı doğru düzenlenir. M8, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde önemli bir rol oynayan bir sinyal zinciri olan Toll benzeri reseptör yolu ile oldukça ilişkilidir (30). M22 aynı zamanda çeviri sonrası modifikasyonla da yakından ilişkilidir. Oligodendrositler açısından zengin olan M2, AD patolojisi ile güçlü bir pozitif korelasyon gösterir ve nükleozid sentezi ve DNA replikasyonu ile ontolojik bir bağlantı gösterir; bu da hastalıklarda hücre çoğalmasının arttığına işaret eder. Genel olarak bu bulgular, daha önce AD ağı proteomunda gözlemlediğimiz glial modüllerin yükselişini desteklemektedir (13, 17). Şu anda ağdaki birçok AD ile ilişkili glial modülün, kontrol ve PD vakalarında daha düşük ekspresyon seviyeleri gösterdiği ve bunların AD'de yüksek olan hastalık spesifikliğini vurguladığı bulunmuştur (Şekil S2C).
Ağ proteomumuzdaki yalnızca dört modül (M1, M3, M10 ve M32) AD patolojisi ile güçlü bir şekilde negatif ilişkilidir (P <0,05) (Şekil 2, B ve C). Hem M1 hem de M3 nöronal belirteçler açısından zengindir. M1 sinaptik sinyallerle oldukça ilişkilidir, M3 ise mitokondriyal fonksiyonla yakından ilişkilidir. M10 ve M32 için hücre tipi zenginleşmesine dair bir kanıt yoktur. M32, M3 ile hücre metabolizması arasındaki bağlantıyı yansıtırken M10, hücre büyümesi ve mikrotübül fonksiyonuyla oldukça ilişkilidir. AD ile karşılaştırıldığında, dört modülün tümü kontrol ve PD açısından artırılarak hastalığa özgü AD değişiklikleri sağlanır (Şekil S2C). Genel olarak bu sonuçlar, daha önce AD'de gözlemlediğimiz nöron açısından zengin modüllerin bolluğunun azaldığını desteklemektedir (13, 17). Özetle, keşfettiğimiz beyin proteomunun ağ analizi, önceki bulgularımızla tutarlı olarak AD'ye özel olarak değiştirilmiş modüller üretti.
AD, bireylerin klinik bilişsel gerileme olmadan amiloid birikimi sergilediği erken asemptomatik aşama (AsymAD) ile karakterizedir (5, 31). Bu asemptomatik aşama, erken teşhis ve müdahale için kritik bir pencereyi temsil eder. Daha önce bağımsız veri setlerinde AsymAD ve AD beyin ağı proteomunun güçlü modüler korunmasını göstermiştik (13, 17). Şu anda keşfettiğimiz beyin ağının önceki bulgularla tutarlı olduğundan emin olmak için 27 DLPFC kuruluşundan alınan çoğaltılmış veri setindeki 44 modülün korunmasını analiz ettik. Bu kuruluşlar arasında kontrol (n = 10), AsymAD (n = 8) ve AD (n = 9) vakaları bulunmaktadır. Kontrol ve AD örnekleri, keşif beyin kohortumuzun analizine dahil edildi (Tablo S1B), AsymAD vakaları ise yalnızca replikasyon kohortunda benzersizdi. Bu AsymAD vakaları da Emory Goizueta ADRC beyin bankasından geldi. Ölüm sırasında biliş normal olmasına rağmen amiloid seviyeleri anormal derecede yüksekti (ortalama CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tablo S1B).
Bu 27 beyin dokusunun TMT-MS analizi, 11.244 proteomun miktarının belirlenmesiyle sonuçlandı. Bu son sayım yalnızca numunelerin en az %50'sinde miktarı belirlenen proteinleri içerir. Bu çoğaltılmış veri seti, keşif beyin analizimizde tespit edilen 8817 proteinin 8638'ini (%98,0) içerir ve kontrol ile AD kohortları arasında yaklaşık 3000 önemli ölçüde değiştirilmiş protein içerir (P <0,05, varyans analizi için Tukey eşleştirilmiş t testinden sonra) ( Tablo S2F). Bu diferansiyel olarak eksprese edilen proteinler arasında 910, AD ve beyin proteom kontrol vakaları arasında da önemli düzeyde değişiklikler gösterdi (P <0.05, ANOVA Tukey eşleştirilmiş t-testinden sonra). Bu 910 işaretleyicinin proteomlar arasındaki değişim yönünde oldukça tutarlı olduğunu belirtmekte fayda var (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Şekil S3A). Artan proteinler arasında, veri setleri arasında en tutarlı değişiklikleri gösteren proteinler esas olarak glial açıdan zengin M5 ve M18 modüllerinin (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 ve GFAP) üyeleridir. İndirgenmiş proteinler arasında en tutarlı değişikliklere sahip olanlar neredeyse yalnızca sinapsla ilişkili M1 modülünün (NPTX2, VGF ve RPH3A) üyeleriydi. Ayrıca midkine (MDK), CD44, salgılanan kıvrılmış protein 1 (SFRP1) ve VGF'nin AD ile ilişkili değişikliklerini western blotlama ile doğruladık (Şekil S3B). Modül koruma analizi, beyin proteomundaki protein modüllerinin (34/44) yaklaşık %80'inin replikasyon veri setinde önemli ölçüde korunduğunu gösterdi (z-skoru> 1,96, FDR düzeltilmiş P <0,05) (Şekil S3C). Bu modüllerden on dördü iki proteom arasında özel olarak ayrılmıştı (z-skoru> 10, FDR düzeltilmiş P <1,0 × 10−23). Genel olarak, beyin proteomu arasındaki diferansiyel ekspresyon ve modüler kompozisyondaki yüksek derecede tutarlılığın keşfi ve kopyalanması, AD frontal korteks proteinlerindeki değişikliklerin tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır. Ayrıca AsymAD ile daha ileri düzey hastalıkların çok benzer beyin ağı yapısına sahip olduğu da doğrulandı.
Beyin replikasyon veri setindeki diferansiyel ifadenin daha ayrıntılı bir analizi, AsymAD ile kontrol arasında toplam 151 önemli ölçüde değiştirilmiş protein dahil olmak üzere önemli derecede AsymAD protein değişikliklerinin altını çizer (P <0.05) (Şekil S3D). Amiloid yüküyle uyumlu olarak AsymAD ve AD'nin beynindeki APP önemli ölçüde arttı. MAPT yalnızca AD'de önemli ölçüde değişir; bu, artan düğümlenme seviyeleri ve bunun bilişsel gerileme ile bilinen korelasyonu ile tutarlıdır (5, 7). Glial açısından zengin modüller (M5 ve M18), AsymAD'deki artan proteinlere yüksek oranda yansıtılırken, nöronla ilgili M1 modülü, AsymAD'deki azalmış proteinleri en iyi temsil eden modüldür. Bu AsymAD belirteçlerinin birçoğu semptomatik hastalıklarda daha büyük değişiklikler göstermektedir. Bu belirteçler arasında beyin tümörleri, göz ve uzuvların gelişimi ile ilişkili olan M18'e ait bir glial protein olan SMOC1 bulunmaktadır (32). MDK, M18'in diğer bir üyesi olan hücre büyümesi ve anjiyogenez (33) ile ilgili heparin bağlayıcı bir büyüme faktörüdür. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında AsymAD önemli ölçüde arttı, ardından AD'de daha büyük bir artış oldu. Buna karşılık, AsymAD beyninde sinaptik protein nöropentraksin 2 (NPTX2) önemli ölçüde azaldı. NPTX2 daha önce nörodejenerasyonla ilişkilendirilmişti ve uyarıcı sinapslara aracılık etmede tanınmış bir role sahipti (34). Genel olarak, bu sonuçlar AD'de hastalığın şiddetiyle birlikte ilerleyen çeşitli farklı klinik öncesi protein değişikliklerini ortaya koymaktadır.
Beyin proteomunun keşfinde önemli bir protein kapsamı derinliği elde ettiğimiz göz önüne alındığında, bunun ağ düzeyindeki AD transkriptomuyla örtüşmesini daha iyi anlamaya çalışıyoruz. Bu nedenle, keşfettiğimiz beyin proteomunu, AD (n = 308) ve kontrol (n = 157) DLPFC dokularındaki 18.204 genin mikrodizi ölçümünden daha önce oluşturduğumuz modülle karşılaştırdık (13). örtüşüyor. Toplamda, birçoğu nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve mikroglia (Şekil 3A) dahil olmak üzere belirli hücre türlerinin zenginleşmesini gösteren 20 farklı RNA modülü belirledik. AD'deki bu modüllerin çoklu değişiklikleri Şekil 3B'de gösterilmektedir. Daha derin etiketlenmemiş MS proteomunu (yaklaşık 3000 protein) (13) kullanan önceki protein-RNA örtüşme analizimizle tutarlı olarak, bulduğumuz beyin proteom ağındaki 44 modülün çoğu transkriptom ağındadır. beyin proteomunda yüksek düzeyde tutulan 34 protein modülünün keşfi ve çoğaltılması, yalnızca 14'ü (~%40) Fisher'in kesin testini (FET) geçti ve transkriptomla istatistiksel olarak anlamlı bir örtüşmenin olduğu kanıtlandı (Şekil 3A). DNA hasarı onarımı (P-M25 ve P-M19), protein translasyonu (P-M7 ve P-M20), RNA bağlama/ekleme (P-M16 ve P-M21) ve protein hedefleme (P-M13 ve P-) ile uyumludur M23), transkriptomdaki modüllerle örtüşmez. Bu nedenle, mevcut örtüşme analizinde (13) daha derin bir proteom veri seti kullanılmasına rağmen, AD ağ proteomunun çoğu, transkriptom ağına eşlenmemiştir.
(A) Hipergeometrik FET, AD transkriptomunun (üstte) RNA modülünde hücre tipine özgü belirteçlerin zenginleşmesini ve AD beyninin RNA (x ekseni) ve protein (y ekseni) modülleri arasındaki örtüşme derecesini gösterir. (alt) . Kırmızı gölgelemenin yoğunluğu, üst paneldeki hücre tiplerinin zenginleşme derecesini ve alt paneldeki modüllerin üst üste binme yoğunluğunu gösterir. Yıldız işaretleri istatistiksel önemi gösterir (P <0.05). (B) Her transkriptom modülünün karakteristik genleri ile AD durumu arasındaki korelasyon derecesi. Soldaki modüller AD ile en olumsuz korelasyona sahip olanlardır (mavi), sağdaki modüller ise AD ile en pozitif korelasyona sahip olanlardır (kırmızı). Log-dönüştürülmüş BH-düzeltilmiş P değeri, her korelasyonun istatistiksel anlamlılık derecesini gösterir. (C) Paylaşılan hücre tipi zenginleştirmeye sahip önemli örtüşen modüller. (D) Örtüşen modüldeki etiketli proteinin (x ekseni) ve RNA'nın (y ekseni) log2 kat değişiminin korelasyon analizi. İlgili P değeriyle Pearson korelasyon katsayısı görüntülenir. Mikro, mikroglia; gök cisimleri, astrositler. CT, kontrol.
Çoğu örtüşen protein ve RNA modülü benzer hücre tipi zenginleştirme profillerini ve tutarlı AD değişim yönlerini paylaşır (Şekil 3, B ve C). Başka bir deyişle, beyin proteomunun sinapsla ilişkili M1 modülü (PM1), AD'de bulunan üç nöron açısından zengin homolog RNA modülüyle (R-M1, R-M9 ve R-M16) eşlenir. azaltılmış bir seviye. Benzer şekilde, gliyal açısından zengin M5 ve M18 protein modülleri, astrositler ve mikroglial belirteçler (R-M3, R-M7 ve R-M10) açısından zengin RNA modülleri ile örtüşür ve hastalıkların artmasında oldukça rol oynar. İki veri seti arasındaki bu paylaşılan modüler özellikler, beyin proteomunda gözlemlediğimiz hücre tipi zenginleşmesini ve hastalıkla ilişkili değişiklikleri daha da desteklemektedir. Ancak bu paylaşılan modüllerdeki bireysel belirteçlerin RNA ve protein seviyeleri arasında birçok önemli farklılık gözlemledik. Bu örtüşen modüller (Şekil 3D) içindeki moleküllerin proteomik ve transkriptomiklerinin diferansiyel ifadesinin korelasyon analizi bu tutarsızlığı vurgulamaktadır. Örneğin, APP ve diğer bazı glial modül proteinleri (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 ve SFRP1), AD proteomunda önemli bir artış gösterdi ancak AD transkriptomunda neredeyse hiçbir değişiklik olmadı. Bu proteine özgü değişiklikler amiloid plaklarla yakından ilişkili olabilir (23, 35), bu da patolojik değişikliklerin kaynağının proteom olduğunu vurgular ve bu değişiklikler transkriptoma yansımayabilir.
Beyni ve keşfettiğimiz BOS proteomlarını bağımsız olarak analiz ettikten sonra, beyin ağının patofizyolojisi ile ilgili AD CSF biyobelirteçlerini tanımlamak için iki veri setinin kapsamlı bir analizini gerçekleştirdik. İlk önce iki proteomun örtüşmesini tanımlamalıyız. BOS'un AD'li beyindeki nörokimyasal değişiklikleri yansıttığı yaygın olarak kabul edilse de (4), AD'li beyin ile BOS proteomu arasındaki örtüşmenin kesin derecesi belirsizdir. İki proteomumuzda tespit edilen ortak gen ürünlerinin sayısını karşılaştırarak, beyin omurilik sıvısında tanımlanan proteinlerin yaklaşık %70'inin (n = 1936) beyinde de ölçüldüğünü bulduk (Şekil 4A). Bu örtüşen proteinlerin çoğu (n = 1721), keşif beyin veri setindeki 44 ortak ifade modülünden biriyle eşlenir (Şekil 4B). Beklendiği gibi, en büyük altı beyin modülü (M1'den M6'ya) en fazla miktarda BOS örtüşmesini sergiledi. Bununla birlikte, beklenmedik derecede yüksek bir örtüşme derecesi elde eden, kendi boyutunun iki katı olan bir beyin modülünden daha büyük olan daha küçük beyin modülleri (örneğin, M15 ve M29) vardır. Bu bizi beyin ve beyin omurilik sıvısı arasındaki örtüşmeyi hesaplamak için daha ayrıntılı, istatistiksel olarak yönlendirilen bir yöntem benimsemeye motive ediyor.
(A ve B) Keşif beyninde ve CSF veri setlerinde tespit edilen proteinler örtüşüyor. Bu örtüşen proteinlerin çoğu, beyin ortak ekspresyon ağının 44 ortak ekspresyon modülünden biriyle ilişkilidir. (C) Beyin omurilik sıvısı proteomu ile beyin ağı proteomu arasındaki örtüşmeyi keşfedin. Isı haritasının her satırı, hipergeometrik FET'in ayrı bir örtüşme analizini temsil eder. Üst sıra, beyin modülü ile tüm BOS proteomu arasındaki örtüşmeyi (gri/siyah gölgeleme) göstermektedir. İkinci satır, beyin modülleri ile BOS proteini (kırmızıyla gölgelendirilmiş) arasındaki örtüşmenin AD'de önemli ölçüde yukarı doğru düzenlendiğini göstermektedir (P <0.05). Üçüncü sıra, beyin modülleri ile BOS proteini (mavi gölgeleme) arasındaki örtüşmenin AD'de önemli ölçüde aşağı regüle edildiğini göstermektedir (P <0.05). FET'ten türetilen P değerini düzeltmek için BH yöntemini kullanın. (D) Hücre türü ilişkisine ve ilgili GO terimlerine dayalı katlanır modül paneli. Bu paneller, BOS proteomunda anlamlı diferansiyel ekspresyona sahip olan beyinle ilgili toplam 271 protein içerir.
Tek kuyruklu FET'leri kullanarak, CSF proteomu ve bireysel beyin modülleri arasındaki protein örtüşmesinin önemini değerlendirdik. Analiz, BOS veri setindeki toplam 14 beyin modülünün istatistiksel olarak anlamlı örtüşmelere (FDR ayarlı P <0,05) ve örtüşme önemine yakın olan ek bir modüle (M18) sahip olduğunu (FDR ayarlı P = 0,06) ortaya çıkardı (Şekil 4C) , üst sıra). Ayrıca diferansiyel olarak eksprese edilen CSF proteinleriyle güçlü bir şekilde örtüşen modüllerle de ilgileniyoruz. Bu nedenle, (i) CSF proteininin AD'de önemli ölçüde arttığını ve (ii) CSF proteininin AD'de önemli ölçüde azaldığını belirlemek için iki ek FET analizi uyguladık (P <0.05, eşleştirilmiş t testi AD/kontrol) Anlamlı örtüşmeye sahip beyin modülleri aralarında. Şekil 4C'nin orta ve alt satırlarında gösterildiği gibi, bu ek analizler 44 beyin modülünden 8'inin AD CSF'ye eklenen proteinle (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 ve M38) önemli ölçüde örtüştüğünü göstermektedir. . ), yalnızca iki modül (M6 ve M15) AD CSF'deki azaltılmış protein ile anlamlı bir örtüşme gösterdi. Beklendiği gibi, 10 modülün tümü, CSF proteomu ile en yüksek örtüşmeye sahip 15 modülde yer almaktadır. Bu nedenle, bu 15 modülün AD'li beyinden türetilen BOS biyobelirteçlerinin yüksek verimli kaynakları olduğunu varsayıyoruz.
Bu 15 örtüşen modülü, WGCNA ağaç diyagramındaki yakınlıklarına ve hücre tipleri ve gen ontolojisi ile ilişkilerine bağlı olarak beş büyük protein paneline katladık (Şekil 4D). İlk panel, nöron belirteçleri ve sinapsla ilişkili proteinler (M1 ve M12) açısından zengin modüller içerir. Sinaptik panel toplam 94 protein içeriyor ve CSF proteomundaki seviyeler önemli ölçüde değişti, bu da onu beş panel arasında beyinle ilgili CSF belirteçlerinin en büyük kaynağı haline getirdi. İkinci grup (M6 ve M15), “yara iyileşmesi” (M6) ve “humoral immün tepkinin düzenlenmesi” (M15) gibi endotel hücre belirteçleri ve vasküler gövde ile yakın bağlantıyı gösterdi. M15 ayrıca endotel ile yakından ilişkili olan lipoprotein metabolizmasıyla da oldukça ilişkilidir (36). Vasküler panel beyinle ilgili 34 BOS belirteci içerir. Üçüncü grup, oligodendrosit belirteçleri ve hücre proliferasyonu ile önemli ölçüde ilişkili olan modülleri (M2 ve M4) içerir. Örneğin M2'nin üst düzey ontoloji terimleri arasında "DNA replikasyonunun pozitif düzenlenmesi" ve "pürin biyosentezi süreci" yer alır. M4'ünkiler arasında ise "glial hücre farklılaşması" ve "kromozom ayrılması" yer alıyor. Miyelinasyon paneli beyinle ilgili 49 BOS belirteci içerir.
Dördüncü grup en fazla modülü içerir (M30, M29, M18, M24 ve M5) ve neredeyse tüm modüller mikroglia ve astrosit belirteçleri açısından önemli ölçüde zengindir. Miyelinasyon paneline benzer şekilde dördüncü panel de hücre çoğalmasıyla yakından ilişkili modülleri (M30, M29 ve M18) içerir. Bu gruptaki diğer modüller, "bağışıklık etkisi süreci" (M5) ve "bağışıklık tepkisinin düzenlenmesi" (M24) gibi immünolojik terimlerle oldukça ilişkilidir. Glial bağışıklık grubu beyinle ilgili 42 BOS belirteci içerir. Son olarak son panel, tümü vücutta enerji depolama ve metabolizma ile ilgili olan dört modül (M44, M3, M33 ve M38) üzerinde beyinle ilgili 52 işaret içerir. Bu modüllerin en büyüğü (M3) mitokondri ile yakından ilişkilidir ve nörona özgü belirteçler açısından zengindir. M38, bu metabolomdaki daha küçük modül üyelerinden biridir ve aynı zamanda orta derecede nöron özgüllüğü sergiler.
Genel olarak, bu beş panel AD korteksindeki çok çeşitli hücre tiplerini ve fonksiyonlarını yansıtır ve toplu olarak beyinle ilgili 271 BOS işaretleyicisini içerir (Tablo S2G). Bu MS sonuçlarının geçerliliğini değerlendirmek için, çoğullama yetenekleri, yüksek hassasiyeti ve özgüllüğü olan ortogonal antikor bazlı bir teknoloji olan yakınlık uzatma tahlilini (PEA) kullandık ve bulduğumuz beyin omurilik sıvısı örneklerini yeniden analiz ettik. Bu 271 biyobelirtecin bir alt kümesi (n = 36). Bu 36 hedef, MS tabanlı bulgularımızla yakından ilişkili olan PEA'nın AD katındaki değişikliği göstermektedir (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), bu da kapsamlı MS analizimizin sonuçlarını güçlü bir şekilde doğrulamıştır (Şekil S4) ).
Sinaptik sinyalleşmeden enerji metabolizmasına kadar beş grubumuzun vurguladığı biyolojik temaların tümü AD'nin patogeneziyle ilgilidir (1-3). Bu nedenle, bu panelleri içeren 15 modülün tümü, keşfettiğimiz beyin proteomundaki AD patolojisiyle ilgilidir (Şekil 2B). En dikkate değer olanı, glial modüllerimiz arasındaki yüksek pozitif patolojik korelasyon ve en büyük nöronal modüllerimiz (M1 ve M3) arasındaki güçlü negatif patolojik korelasyondur. Çoğaltılmış beyin proteomumuzun diferansiyel ekspresyon analizi (Şekil S3D) ayrıca M5 ve M18'den türetilmiş glial proteinleri de vurgular. AsymAD ve semptomatik AD'de en fazla glial proteinler artarken, M1 ile ilişkili sinapslarda en fazla protein azalır. Bu gözlemler, beş grupta tanımladığımız 271 beyin omurilik sıvısı belirtecinin, erken asemptomatik aşamalarda meydana gelenler de dahil olmak üzere AD korteksindeki hastalık süreçleriyle ilişkili olduğunu göstermektedir.
Beyin ve omurilik sıvısındaki panel proteinlerinin değişim yönünü daha iyi analiz etmek amacıyla, örtüşen 15 modülün her biri için aşağıdakileri çizdik: (i) beyin veri setinde modül bolluk seviyesini ve (ii) modülü bulduk. protein Fark beyin omurilik sıvısında ifade edilir (Şekil S5). Daha önce de belirtildiği gibi WGCNA, beyindeki modül bolluğunu veya karakteristik protein değerini belirlemek için kullanılır (13). Volkan haritası, beyin omurilik sıvısındaki (AD/kontrol) modüler proteinlerin diferansiyel ifadesini tanımlamak için kullanılır. Bu rakamlar, beş panelden üçünün beyinde ve omurilik sıvısında farklı ifade eğilimleri gösterdiğini göstermektedir. Sinaps panelinin iki modülü (M1 ve M12), AD'li beyindeki bolluk seviyesinde bir azalma gösterir, ancak AD CSF'deki artan proteinle önemli ölçüde örtüşür (Şekil S5A). Metabolomu (M3 ve M38) içeren nöronla ilgili modüller, benzer beyin ve beyin omurilik sıvısı ekspresyon modellerinin tutarsız olduğunu gösterdi (Şekil S5E). Vasküler panel de farklı ekspresyon eğilimleri gösterdi, ancak modülleri (M6 ve M15) AD'li beyinde orta derecede artmış ve hastalıklı CSF'de azalmış (Şekil S5B). Geri kalan iki panel, proteinleri her iki bölmede de sürekli olarak yukarı doğru düzenlenen büyük glial ağları içerir (Şekil S5, C ve D).
Bu eğilimlerin bu panellerdeki tüm işaretçiler için ortak olmadığını lütfen unutmayın. Örneğin, sinaptik panel AD'li beyinde ve CSF'de önemli ölçüde azaltılmış birkaç protein içerir (Şekil S5A). Bu aşağı regüle edilmiş beyin omurilik sıvısı belirteçleri arasında M1'in NPTX2 ve VGF'si ve M12'nin kromogranin B'si bulunur. Ancak bu istisnalara rağmen sinaptik belirteçlerimizin çoğu AD omurilik sıvısında yükselmiştir. Genel olarak bu analizler, beş panelimizin her birinde beyin ve beyin omurilik sıvısı seviyelerindeki istatistiksel olarak anlamlı eğilimleri ayırt edebildi. Bu eğilimler AD'de beyin ve BOS protein ekspresyonu arasındaki karmaşık ve sıklıkla farklı ilişkiyi vurgulamaktadır.
Daha sonra, 271 biyobelirteç setimizi en ümit verici ve tekrarlanabilir hedeflere daraltmak için yüksek verimli MS replikasyon analizini (BOS replikasyonu 1) kullandık(Şekil 5A). CSF kopyası 1, kontrol, AsymAD ve AD kohortu dahil olmak üzere Emory Goizueta ADRC'den toplam 96 örnek içerir (Tablo S1A). Bu AD vakaları, hafif bilişsel düşüş (ortalama MoCA, 20.0 ± 3.8) ve beyin omurilik sıvısında doğrulanan AD biyobelirteçlerindeki değişikliklerle karakterize edilir (Tablo S1A). Bulduğumuz CSF analizinin aksine, bu çoğaltma, tek tek numunelerin bağışıklık sisteminin tükenmesi ihtiyacını ortadan kaldıran basitleştirilmiş bir numune hazırlama protokolü de dahil olmak üzere, daha verimli ve yüksek verimli bir "tek atış" MS yöntemi (çevrimdışı parçalama olmadan) kullanılarak gerçekleştirilir. . Bunun yerine, daha az miktarda bulunan proteinlerin sinyalini yükseltmek için bağışıklığı tüketen tek bir "geliştirme kanalı" kullanılır (37). Toplam proteom kapsamını azaltsa da, bu tek atış yöntemi makine süresini önemli ölçüde azaltır ve canlı olarak analiz edilebilecek TMT etiketli örneklerin sayısını artırır (17, 38). Toplamda, analiz 96 vakada 1.183 proteomla eşlenen 6.487 peptid tanımladı. Bulduğumuz CSF analizinde olduğu gibi, sonraki hesaplamalara yalnızca örneklerin en az %50'sinde miktarı belirlenen proteinler dahil edildi ve veriler, yaş ve cinsiyetin etkileri açısından regrese edildi. Bu, %95'i bulunan CSF veri setinde de tanımlanan 792 proteomun nihai miktarının belirlenmesine yol açtı.
(A) İlk kopyalanan CSF kohortunda doğrulanan ve son panele dahil edilen beyinle ilgili CSF protein hedefleri (n = 60). (B'den E'ye) Dört CSF replikasyon kohortunda ölçülen panel biyobelirteç seviyeleri (bileşik z skorları). Her tekrarlı analizde bolluktaki değişikliklerin istatistiksel önemini değerlendirmek için eşleştirilmiş t testleri veya Tukey'in düzeltme sonrası ANOVA'sı kullanıldı. CT, kontrol.
Kapsamlı analiz yoluyla beyinle ilgili 271 CSF hedefimizi doğrulamakla özellikle ilgilendiğimiz için, bu kopyalanmış proteomun daha fazla incelenmesini bu belirteçlerle sınırlayacağız. Bu 271 protein arasında 100'ü CSF replikasyonu 1'de tespit edildi. Şekil S6A, kontrol ve AD replikasyon numuneleri arasındaki bu 100 örtüşen işaretleyicinin diferansiyel ifadesini gösterir. AD'de en fazla sinaptik ve metabolit histonlar artarken, hastalıkta en fazla vasküler proteinler azalır. Örtüşen 100 işaretleyicinin çoğu (n = 70), iki veri setinde aynı değişim yönünü korudu (Şekil S6B). Bu 70 doğrulanmış beyinle ilgili BOS belirteci (Tablo S2H), daha önce gözlemlenen panel ekspresyon eğilimlerini, yani vasküler proteinlerin aşağı regülasyonunu ve diğer tüm panellerin yukarı regülasyonunu büyük ölçüde yansıtmaktadır. Doğrulanmış bu 70 proteinden yalnızca 10'u, AD bolluğunda bu panel eğilimleriyle çelişen değişiklikler gösterdi. Beynin ve beyin omurilik sıvısının genel eğilimini en iyi yansıtan bir panel oluşturmak için bu 10 proteini, sonunda doğruladığımız ilgi panelinden hariç tuttuk (Şekil 5A). Bu nedenle panelimiz sonuçta farklı örnek hazırlama ve MS platform analizi kullanılarak iki bağımsız CSF AD kohortunda doğrulanan toplam 60 protein içerir. CSF kopya 1 kontrolü ve AD vakalarındaki bu son panellerin z-skoru ifade grafikleri, bulduğumuz CSF kohortunda gözlemlenen panel eğilimini doğruladı (Şekil 5B).
Bu 60 protein arasında, birçok çalışmada AD ile ilişkilendirilen bir proinflamatuar sitokin olan osteopontin (SPP1) (39-41) ve bir sinaptik protein olan GAP43 gibi AD ile ilişkili olduğu bilinen moleküller bulunmaktadır. bu açıkça nörodejenerasyonla bağlantılıdır (42). En tam olarak doğrulanan proteinler, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ile ilişkili süperoksit dismutaz 1 (SOD1) ve Parkinson hastalığı ile ilişkili desakkaraz (PARK7) gibi diğer nörodejeneratif hastalıklarla ilgili belirteçlerdir. Ayrıca SMOC1 ve beyin açısından zengin membran bağlanma sinyal proteini 1 (BASP1) gibi diğer birçok belirtecin, nörodejenerasyonla önceki bağlantıları sınırlı olduğunu da doğruladık. CSF proteomundaki genel bolluklarının düşük olması nedeniyle, MAPT'yi ve diğer bazı AD ile ilgili proteinleri (örneğin, NEFL ve NRGN) güvenilir bir şekilde tespit etmek için bu yüksek verimli tek atış tespit yöntemini kullanmamızın zor olduğunu belirtmekte fayda var. ) (43, 44).
Daha sonra bu 60 öncelik paneli işaretleyicisini üç ek tekrarlı analizde kontrol ettik. CSF Kopyası 2'de, Emory Goizueta ADRC'den (17) 297 kontrol ve AD örneğinden oluşan bağımsız bir kohortu analiz etmek için tek bir TMT-MS kullandık. CSF replikasyonu 3, Lozan, İsviçre'deki 120 kontrol ve AD hastasından elde edilen mevcut TMT-MS verilerinin yeniden analizini içeriyordu (45). Her veri kümesindeki 60 öncelik işaretinin üçte ikisinden fazlasını tespit ettik. İsviçre'deki çalışmada farklı MS platformları ve TMT ölçüm yöntemleri (45, 46) kullanılmış olsa da, tekrarlanan iki analizde panel eğilimlerimizi güçlü bir şekilde yeniden oluşturduk (Şekil 5, C ve D ve Tablolar S2, I ve J). Grubumuzun hastalık özgüllüğünü değerlendirmek amacıyla, yalnızca kontrol (n = 18) ve AD (n = 17) vakalarını değil aynı zamanda PD (n = 17) vakalarını da içeren dördüncü replikasyon veri setini (BOS replikasyonu 4) analiz etmek için TMT-MS'yi kullandık ( n = 14)) ALS (n = 18) ve frontotemporal demans (FTD) örnekleri (n = 11) (Tablo S1A). Bu gruptaki panel proteinlerinin neredeyse üçte ikisini başarıyla ölçtük (60 üzerinden 38). Bu sonuçlar, beş biyobelirteç panelinin tamamındaki AD'ye özgü değişiklikleri vurgulamaktadır (Şekil 5E ve Tablo S2K). Metabolit grubundaki artış en güçlü AD spesifikliğini gösterdi, bunu miyelinasyon ve glial grup izledi. FTD daha az bir ölçüde bu paneller arasında da bir artış göstermektedir ve bu da benzer potansiyel ağ değişikliklerini yansıtabilmektedir (17). Buna karşılık, ALS ve PD, kontrol grubuyla hemen hemen aynı miyelinasyon, glial ve metabolom profillerini gösterdi. Genel olarak numune hazırlama, MS platformu ve TMT ölçüm yöntemlerindeki farklılıklara rağmen tekrarlanan bu analizler, öncelikli panel işaretleyicilerimizin 500'den fazla benzersiz CSF numunesinde son derece tutarlı AD'ye özgü değişikliklere sahip olduğunu göstermektedir.
AD nörodejenerasyonu, bilişsel semptomların başlangıcından birkaç yıl önce geniş çapta tanınmaktadır, bu nedenle AsymAD biyobelirteçlerine acil ihtiyaç vardır (5, 31). Bununla birlikte, giderek daha fazla kanıt, AsymAD'nin biyolojisinin homojen olmaktan uzak olduğunu ve risk ile dirençliliğin karmaşık etkileşiminin, sonraki hastalık ilerlemesinde büyük bireysel farklılıklara yol açtığını göstermektedir (47). AsymAD vakalarını tanımlamak için kullanılmasına rağmen, temel BOS biyobelirteçlerinin (Aβ1-42, toplam tau ve p-tau) düzeylerinin, kimin demansa ilerleyeceğini güvenilir bir şekilde tahmin edebildiği kanıtlanmamıştır (4, 7), bu da daha fazla olabileceğine işaret etmektedir. Bu popülasyonun riskini doğru bir şekilde sınıflandırmak için beyin fizyolojisinin birçok yönünü temel alan bütünsel biyobelirteç araçlarının dahil edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, daha sonra AD onaylı biyobelirteç panelimizi, CSF kopya 1'in AsymAD popülasyonunda analiz ettik. Bu 31 AsymAD vakası, anormal çekirdek biyobelirteç seviyeleri (Aβ1–42/toplam tau ELISA oranı, <5,5) ve tam biliş (ortalama MoCA, 27,1) gösterdi. ± 2,2) (Tablo S1A). Ek olarak, AsymAD'lı tüm bireylerin klinik demans puanı 0'dır; bu da günlük bilişsel veya işlevsel performansta bir düşüş olduğuna dair bir kanıt olmadığını gösterir.
İlk olarak AsymAD kohortu da dahil olmak üzere 96 CSF kopyasının 1 tamamındaki doğrulanmış panellerin seviyelerini analiz ettik. AsymAD grubundaki birkaç panelin önemli AD benzeri bolluk değişikliklerine sahip olduğunu, vasküler panelin AsymAD'de düşüş eğilimi gösterdiğini, diğer tüm panellerin ise yükseliş eğilimi gösterdiğini tespit ettik (Şekil 6A). Bu nedenle tüm paneller ELISA Aβ1-42 ve toplam tau düzeyleriyle oldukça anlamlı bir korelasyon gösterdi (Şekil 6B). Buna karşılık, grup ile MoCA puanı arasındaki korelasyon nispeten zayıftır. Bu analizlerden elde edilen en çarpıcı bulgulardan biri AsymAD kohortunda panel bolluğunun geniş aralığıdır. Şekil 6A'da gösterildiği gibi AsymAD grubunun panel düzeyi genellikle kontrol grubunun ve AD grubunun panel düzeyini geçerek nispeten yüksek değişkenlik gösterir. AsymAD'ın bu heterojenliğini daha fazla araştırmak için 96 CSF replikasyonu 1 vakasına Çok Boyutlu Ölçeklendirme (MDS) analizi uyguladık. MDS analizi, veri setindeki belirli değişkenlere dayalı olarak vakalar arasındaki benzerliğin görselleştirilmesine olanak sağlar. Bu küme analizi için, yalnızca CSF keşfi ve replikasyon 1 proteom (n = 29) (Tablo S2L) seviyesinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişikliğe (P <0.05, AD/kontrol) sahip olan doğrulanmış panel işaretleyicilerini kullanıyoruz. Bu analiz, kontrolümüz ve AD vakalarımız arasında net mekansal kümelenme üretti (Şekil 6C). Buna karşılık, bazı AsymAD vakaları açıkça kontrol grubunda kümelenirken diğerleri AD vakalarında yer alıyor. Bu AsymAD heterojenliğini daha fazla araştırmak için MDS haritamızı kullanarak bu AsymAD vakalarının iki grubunu tanımladık. Birinci grup kontrole daha yakın kümelenmiş AsymAD vakalarını içerirken (n = 19), ikinci grup ise AD'ye daha yakın bir marker profiline sahip AsymAD vakaları ile karakterize edildi (n = 12).
(A) AsymAD dahil olmak üzere CSF replikasyon 1 kohortundaki 96 numunenin tamamında BOS biyobelirteç grubunun ifade düzeyi (z-skoru). Panel bolluğu değişikliklerinin istatistiksel önemini değerlendirmek için Tukey'in düzeltme sonrası varyans analizi kullanıldı. (B) ELISA Aβ1-42 ve CSF kopya 1 örneklerinde panel protein bolluğu seviyesinin (z-skoru) MoCA skoru ve toplam tau seviyesi ile korelasyon analizi. İlgili P değeriyle Pearson korelasyon katsayısı görüntülenir. (C) 96 CSF kopya 1 vakasının MDS'si, hem keşif hem de CSF kopya 1 veri setlerinde önemli ölçüde değiştirilmiş olan 29 doğrulanmış panel işaretleyicisinin bolluk düzeylerine dayanıyordu [P <0,05 AD/kontrol (CT)]. Bu analiz, AsymAD grubunu kontrol (n = 19) ve AD (n = 12) alt gruplarına bölmek için kullanıldı. (D) Volkan grafiği, iki AsymAD alt grubu arasındaki -log10 istatistiksel P değerine göre log2 kat değişim (x ekseni) ile tüm CSF replikasyon 1 proteinlerinin diferansiyel ifadesini gösterir. Panel biyobelirteçleri renklidir. (E) Seçim grubu biyobelirteçlerinin CSF replikasyonu 1 bolluk seviyesi, AsymAD alt grupları arasında farklı şekilde ifade edilir. İstatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için Tukey'in sonradan düzeltilmiş varyans analizi kullanıldı.
Bu kontrol ve AD benzeri AsymAD vakaları arasındaki diferansiyel protein ifadesini inceledik (Şekil 6D ve Tablo S2L). Ortaya çıkan yanardağ haritası, iki grup arasında 14 panel işaretinin önemli ölçüde değiştiğini gösteriyor. Bu belirteçlerin çoğu sinaps ve metabolomun üyeleridir. Ancak sırasıyla miyelin ve glial bağışıklık gruplarının üyeleri olan SOD1 ve miristoillenmiş alanin açısından zengin protein kinaz C substratı (MARCKS) da bu gruba aittir (Şekil 6, D ve E). Vasküler panel aynı zamanda AD benzeri AsymAD grubunda AE bağlayıcı protein 1 (AEBP1) ve kompleman aile üyesi C9 dahil olmak üzere önemli ölçüde azalan iki işaretleyiciye de katkıda bulunmuştur. ELISA AB1-42 (P = 0,38) ve p-tau'da (P = 0,28) kontrol ve AD benzeri AsymAD alt grupları arasında anlamlı bir fark yoktu, ancak toplam tau seviyesinde gerçekten anlamlı bir fark vardı (P = 0,0031) ) (Şekil S7). İki AsymAD alt grubu arasındaki değişikliklerin toplam tau seviyelerinden daha önemli olduğunu gösteren birkaç panel işareti vardır (örneğin, YWHAZ, SOD1 ve MDH1) (Şekil 6E). Genel olarak bu sonuçlar, onaylanmış panelimizin asemptomatik hastalığı olan hastaların alt tipini ve potansiyel risk sınıflandırmasını yapabilen biyobelirteçler içerebileceğini göstermektedir.
AD'nin ardındaki çeşitli patofizyolojiyi daha iyi ölçmek ve hedeflemek için sistem tabanlı biyobelirteç araçlarına acil bir ihtiyaç vardır. Bu araçların yalnızca Alzheimer teşhis çerçevemizi değiştirmesi değil, aynı zamanda etkili, hastaya özel tedavi stratejilerinin benimsenmesini de teşvik etmesi bekleniyor (1, 2). Bu amaçla, geniş bir yelpazedeki beyin temelli patofizyolojiyi yansıtan web tabanlı BOS biyobelirteçlerini tanımlamak için AD'li beyin ve CSF'ye tarafsız, kapsamlı bir proteomik yaklaşım uyguladık. Analizimiz, (i) sinapsları, kan damarlarını, miyelin, bağışıklık ve metabolik fonksiyon bozukluklarını yansıtan; (ii) farklı MS platformlarında güçlü tekrarlanabilirlik sergilemek; (iii) AD'nin erken ve geç evreleri boyunca ilerleyici hastalığa özgü değişiklikleri gösterin. Genel olarak, bu bulgular AD araştırmaları ve klinik uygulamalar için çeşitli, güvenilir, web odaklı biyobelirteç araçlarının geliştirilmesine yönelik umut verici bir adımı temsil etmektedir.
Sonuçlarımız AD beyin ağı proteomunun yüksek düzeyde korunmuş organizasyonunu göstermekte ve sistem tabanlı biyobelirteç geliştirme için bir dayanak noktası olarak kullanımını desteklemektedir. Analizimiz, AD ve AsymAD beyinlerini içeren iki bağımsız TMT-MS veri kümesinin güçlü modülerliğe sahip olduğunu göstermektedir. Bu bulgular önceki çalışmalarımızı genişleterek frontal, parietal ve temporal korteksteki birden fazla bağımsız gruptan gelen 2.000'den fazla beyin dokusunun güçlü modüllerinin korunduğunu ortaya koyuyor (17). Bu fikir birliği ağı, gliyal açısından zengin inflamatuar modüllerin artması ve nöron açısından zengin modüllerin azalması dahil olmak üzere mevcut araştırmalarda gözlemlenen hastalıkla ilgili çeşitli değişiklikleri yansıtmaktadır. Mevcut araştırmalar gibi, bu büyük ölçekli ağ da AsymAD'de çeşitli farklı klinik öncesi patofizyoloji gösteren önemli modüler değişikliklere sahiptir (17).
Bununla birlikte, bu son derece muhafazakar sistem temelli çerçeve içerisinde, özellikle AD'nin erken evrelerindeki bireyler arasında daha ince taneli biyolojik heterojenite vardır. Biyobelirteç panelimiz, AsymAD'de birden fazla CSF işaretçisinin anlamlı diferansiyel ifadesini gösteren iki alt grubu tasvir edebilmektedir. Grubumuz, bu iki alt grup arasındaki, temel AD biyobelirteçleri düzeyinde belirgin olmayan biyolojik farklılıkları vurgulayabildi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında bu AsymAD bireylerinin Aβ1-42/toplam tau oranları anormal derecede düşüktü. Bununla birlikte, iki AsymAD alt grubu arasında yalnızca toplam tau seviyeleri önemli ölçüde farklıydı, Aβ1-42 ve p-tau seviyeleri ise nispeten karşılaştırılabilir kaldı. Yüksek CSF tau, bilişsel semptomların Aβ1-42 seviyelerinden daha iyi bir belirleyicisi gibi göründüğünden (7), iki AsymAD kohortunun hastalığın ilerlemesi konusunda farklı risklere sahip olabileceğinden şüpheleniyoruz. AsymAD'ımızın sınırlı örneklem büyüklüğü ve boylamsal verilerin eksikliği göz önüne alındığında, bu sonuçları güvenle çıkarmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Ancak bu sonuçlar, sistem bazlı bir BOS panelinin, hastalığın asemptomatik evresinde bireyleri etkili bir şekilde sınıflandırma yeteneğimizi geliştirebileceğini göstermektedir.
Genel olarak bulgularımız AD'nin patogenezinde çoklu biyolojik fonksiyonların rolünü desteklemektedir. Ancak düzensiz enerji metabolizması, onaylanmış beş etiketleme panelimizin hepsinin öne çıkan teması haline geldi. Hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz 1 (HPRT1) ve laktat dehidrojenaz A (LDHA) gibi metabolik proteinler, AD CSF'deki artışın yüksek oranda tekrarlanabilir cinsiyet olduğunu gösteren, en sağlam şekilde doğrulanmış sinaptik biyobelirteçlerdir. Kan damarlarımız ve glial panellerimiz ayrıca oksidatif maddelerin metabolizmasında rol oynayan çeşitli belirteçler içerir. Bu bulgular, metabolik süreçlerin yalnızca nöronların yüksek enerji talebini karşılamak için değil, aynı zamanda astrositlerin ve diğer glial hücrelerin yüksek enerji talebini karşılamak için beynin tamamında oynadığı anahtar rol ile tutarlıdır (17, 48). Sonuçlarımız, redoks potansiyelindeki değişikliklerin ve enerji yollarındaki kesintilerin, mitokondriyal bozukluklar, glial aracılı inflamasyon ve Vasküler hasar dahil olmak üzere AD'nin patogenezinde yer alan birkaç anahtar süreç arasındaki temel bağlantı olabileceğine dair artan kanıtları desteklemektedir (49). Ek olarak, metabolik beyin omurilik sıvısı biyobelirteçleri, kontrolümüz ve AD benzeri AsymAD alt gruplarımız arasında çok sayıda diferansiyel olarak zengin protein içerir; bu, bu enerji ve redoks yollarının bozulmasının, hastalığın klinik öncesi aşamasında kritik olabileceğini düşündürür.
Gözlemlediğimiz farklı beyin ve beyin omurilik sıvısı paneli eğilimlerinin de ilginç biyolojik sonuçları var. Nöronlar açısından zengin sinapslar ve metabolomlar, AD'li beyinde azalmış seviyeleri ve beyin omurilik sıvısında artan bolluğu gösterir. Nöronların, çok sayıda uzmanlaşmış sinyale enerji sağlamak için sinapslarda enerji üreten mitokondri açısından zengin olduğu göz önüne alındığında (50), bu iki nöron grubunun ifade profillerinin benzerliği beklenir. Nöron kaybı ve hasarlı hücrelerin ekstrüzyonu, daha sonraki hastalıktaki bu beyin ve BOS paneli eğilimlerini açıklayabilir, ancak gözlemlediğimiz erken panel değişikliklerini açıklayamazlar (13). Erken semptomsuz hastalıktaki bu bulguların olası bir açıklaması anormal sinaptik budamadır. Fare modellerindeki yeni kanıtlar, mikroglia aracılı sinaptik fagositozun AD'de anormal şekilde aktive edilebileceğini ve beyinde erken sinaps kaybına yol açabileceğini düşündürmektedir (51). Atılan bu sinaptik materyal BOS'ta birikebilir, bu nedenle nöron panelinde BOS'ta artış gözlemliyoruz. İmmün aracılı sinaptik budama, hastalık süreci boyunca beyinde ve beyin omurilik sıvısında gözlemlediğimiz glial proteinlerdeki artışı da kısmen açıklayabilir. Sinaptik budamaya ek olarak, ekzositik yoldaki genel anormallikler de nöronal belirteçlerin farklı beyin ve BOS ifadelerine yol açabilir. Bir dizi çalışma AD'li beyin patogenezinde eksozom içeriğinin değiştiğini göstermiştir (52). Hücre dışı yol aynı zamanda Aβ'nın çoğalmasında da rol oynar (53, 54). Eksozomal sekresyonun baskılanmasının AD transgenik fare modellerinde AD benzeri patolojiyi azaltabileceğini belirtmekte fayda var (55).
Aynı zamanda vasküler paneldeki protein AD'li beyinde orta derecede bir artış gösterirken, BOS'ta önemli ölçüde azalma gösterdi. Kan-beyin bariyeri (BBB) işlev bozukluğu bu bulguları kısmen açıklayabilir. Birçok bağımsız postmortem insan çalışması AD'de KBB'nin bozulduğunu göstermiştir (56, 57). Bu çalışmalar, beyin kılcal sızıntısı ve kanla taşınan proteinlerin perivasküler birikimi de dahil olmak üzere, endotel hücrelerinin bu sıkı bir şekilde kapatılmış katmanını çevreleyen çeşitli anormal aktiviteleri doğruladı (57). Bu, beyindeki yüksek vasküler proteinler için basit bir açıklama sağlayabilir ancak aynı proteinlerin beyin omurilik sıvısındaki tükenmesini tam olarak açıklayamaz. Bir olasılık, merkezi sinir sisteminin artan iltihaplanma ve oksidatif stres sorununu çözmek için bu molekülleri aktif olarak izole etmesidir. Bu paneldeki en şiddetli BOS proteinlerinin bazılarındaki, özellikle de lipoprotein regülasyonunda rol oynayanların azalması, zararlı düzeydeki inflamasyonun inhibisyonu ve reaktif oksijen türlerinin nöroprotektif süreci ile ilgilidir. Bu, dolaşımdaki oksidatif stres seviyelerinin azaltılmasından sorumlu bir lipoprotein bağlayıcı enzim olan Paroksonaz 1 (PON1) için doğrudur (58, 59). Alfa-1-mikroglobulin/bikunin öncüsü (AMBP), vasküler grubun önemli ölçüde aşağı regüle edilmiş bir başka belirtecidir. Enflamasyonun baskılanması ve nörolojik korumada da rol oynayan lipit taşıyıcı bikunin'in öncüsüdür (60, 61).
Çeşitli ilginç hipotezlere rağmen, biyokimyasal hastalık mekanizmalarının doğrudan tespit edilememesi, keşif odaklı proteomik analizlerin iyi bilinen bir sınırlamasıdır. Bu nedenle, bu biyobelirteç panellerinin arkasındaki mekanizmaları güvenle tanımlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. MS tabanlı klinik analizin geliştirilmesine doğru ilerlemek için gelecekteki yön aynı zamanda seçici veya paralel reaksiyon izleme gibi büyük ölçekli biyobelirteç doğrulaması için hedeflenen kantitatif yöntemlerin kullanılmasını da gerektirir (62). Burada açıklanan CSF protein değişikliklerinin çoğunu doğrulamak için yakın zamanda paralel reaksiyon izlemeyi (63) kullandık. Sırasıyla sinaps, metabolizma ve inflamasyon panellerimizi haritalayan YWHAZ, ALDOA ve SMOC1 dahil olmak üzere çeşitli öncelikli panel hedefleri önemli bir doğrulukla ölçülür (63). Bağımsız Veri Toplama (DIA) ve diğer MS tabanlı stratejiler de hedef doğrulama için faydalı olabilir. Bud ve ark. (64) Son zamanlarda, BOS keşif veri setimizde tanımlanan AD biyobelirteçleri ile üç farklı Avrupa kohortundan yaklaşık 200 CSF örneğinden oluşan bağımsız DIA-MS veri seti arasında önemli bir örtüşme olduğu gösterilmiştir. Bu son çalışmalar panellerimizin güvenilir MS tabanlı tespite dönüşme potansiyelini desteklemektedir. Geleneksel antikor ve aptamer bazlı tespit, aynı zamanda önemli AD biyobelirteçlerinin daha da geliştirilmesi için de önemlidir. CSF'nin düşük bolluğu nedeniyle, bu biyobelirteçleri yüksek verimli MS yöntemleri kullanarak tespit etmek daha zordur. NEFL ve NRGN, kapsamlı analizimizde panele eşlenen ancak tek MS stratejimizi kullanarak güvenilir bir şekilde tespit edilemeyen düşük bolluklu BOS biyobelirteçlerinin bu tür iki örneğidir. PEA gibi birden fazla antikora dayalı hedefleme stratejileri, bu belirteçlerin klinik dönüşümünü destekleyebilir.
Genel olarak bu çalışma, farklı sistemlere dayalı olarak BOS AD biyobelirteçlerinin tanımlanması ve doğrulanması için benzersiz bir proteomik yaklaşım sağlar. Bu işaretleyici panellerin ek AD kohortları ve MS platformları genelinde optimize edilmesi, AD risk sınıflandırmasını ve tedavisini ilerletme konusunda umut verici olabilir. Bu panellerin zaman içindeki boylamsal düzeyini değerlendiren çalışmalar, hangi belirteç kombinasyonunun erken hastalık riskini ve hastalık şiddetindeki değişiklikleri en iyi şekilde sınıflandırdığını belirlemek açısından da kritik öneme sahiptir.
CSF tarafından kopyalanan 3 örnek dışında, bu çalışmada kullanılan tüm BOS örnekleri Emory ADRC veya yakından ilişkili araştırma kurumlarının himayesinde toplanmıştır. Bu proteomik çalışmalarda toplam dört set Emory CSF örneği kullanıldı. BOS kohortunun 20 sağlıklı kontrol ve 20 AD hastasından alınan örnekleri içerdiği bulundu. CSF kopyası 1, 32 sağlıklı kontrol, 31 AsymAD bireyi ve 33 AD bireyinden alınan örnekleri içerir. CSF kopyası 2, 147 kontrol ve 150 AD örneği içerir. Çoklu hastalık CSF replikasyonu 4 kohortu 18 kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD ve 11 FTD örneğini içeriyordu. Emory Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan anlaşmaya göre tüm Emory çalışmasına katılanlar bilgilendirilmiş onam aldı. Alzheimer Merkezleri için 2014 Ulusal Yaşlanma Enstitüsü En İyi Uygulama Kılavuzlarına (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) göre, beyin omurilik sıvısı lomber ponksiyon yoluyla toplandı ve saklandı. Kontrol ve AsymAD ve AD hastalarına Emory Bilişsel Nöroloji Kliniğinde veya Goizueta ADRC'de standart bilişsel değerlendirme uygulandı. Beyin omurilik sıvısı örnekleri INNO-BIA AlzBio3 Luminex ile ELISA Aβ1-42, toplam tau ve p-tau analizi için test edildi (65). ELISA değerleri, yerleşik AD biyobelirteç kesme kriterlerine dayalı olarak deneklerin tanısal sınıflandırmasını desteklemek için kullanılır (66, 67). Diğer BOS tanılarına (FTD, ALS ve PD) ilişkin temel demografik ve tanısal veriler de Emory ADRC'den veya bağlı araştırma kurumlarından elde edilir. Bu Emory CSF vakalarına ilişkin özet vaka meta verileri Tablo S1A'da bulunabilir. İsviçre CSF replikasyon 3 kohortunun özellikleri daha önce yayınlanmıştır (45).
CSF örneği buldu. BOS veri seti keşfimizin derinliğini arttırmak için, yüksek bolluktaki proteinlerin bağışıklık tüketimi, trypsinizasyondan önce gerçekleştirildi. Kısacası, 40 ayrı CSF örneğinden 130 ul CSF ve eşit hacimde (130 ul) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) oda sıcaklığında bir döndürme kolonuna (Thermo Fisher Scientific, A89868) yerleştirildi. sıcaklıkta İnkübe edin). 15 dakika döndürdükten sonra numuneyi 1000 g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Atık numuneyi 30 dakika boyunca 14.000 g'de santrifüj ederek konsantre etmek için bir 3K ultrasantrifüj filtre cihazı (Millipore, UFC500396) kullanıldı. Tüm numune hacimlerini fosfat tamponlu salinle 75 ul'ye kadar seyreltin. Protein konsantrasyonu, üreticinin protokolüne (Thermo Fisher Scientific) göre bisinkoninik asit (BCA) yöntemiyle değerlendirildi. 40 numunenin tamamından alınan bağışıklık sistemi tükenmiş CSF (60 ul), lisil endopeptidaz (LysC) ve trypsin ile sindirildi. Kısacası, numune indirgendi ve 1,2 ul 0,5 M tris-2(-karboksietil)-fosfin ve 3 ul 0,8 M kloroasetamid ile 90°C'de 10 dakika boyunca alkile edildi ve ardından 15 dakika boyunca bir su banyosunda sonikasyona tabi tutuldu. Numune, 6 M üre nihai konsantrasyonuna kadar 193 ul 8 M üre tamponu [8 M üre ve 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] ile seyreltildi. LysC (4,5 μg; Wako), oda sıcaklığında gece boyunca sindirim için kullanılır. Numune daha sonra 50 mM amonyum bikarbonat (ABC) (68) ile 1 M üreye seyreltildi. Eşit miktarda (4,5 μg) trypsin (Promega) ekleyin ve ardından numuneyi 12 saat boyunca inkübe edin. Sindirilmiş peptit çözeltisini nihai %1 formik asit (FA) ve %0,1 trifloroasetik asit (TFA) konsantrasyonuna kadar asitleştirin (66) ve ardından yukarıda açıklandığı gibi (25) 50 mg Sep-Pak C18 kolonu (Waters) ile tuzdan arındırın. . Peptit daha sonra 1 ml %50 asetonitril (ACN) içerisinde elüt edildi. Gruplar (25) boyunca protein miktarını standardize etmek için, 40 CSF örneğinin tamamından 100 ul'lik kısımlar birleştirildi ve karışık bir örnek oluşturuldu ve bu daha sonra beş global dahili standart (GIS) (48) örneğine bölündü. Tüm bireysel numuneler ve birleştirilmiş standartlar, yüksek hızlı vakumla (Labconco) kurutulur.
CSF örneği kopyalar. Dayon ve meslektaşları daha önce immün tükenmeyi ve CSF kopyası 3 örneğinin sindirimini tanımlamışlardı (45, 46). Geriye kalan kopya numuneler bireysel olarak bağışıklığı tükenmemiştir. Bu çıkarılmamış numuneleri daha önce açıklandığı gibi trypsin içinde sindirin (17). Tekrarlanan her analiz için, her numuneden elüte edilen peptidin 120 ul'lik alikuotları bir araya toplandı ve TMT etiketli global dahili standart (48) olarak kullanılmak üzere eşit hacimli alikotlara bölündü. Tüm bireysel numuneler ve birleştirilmiş standartlar, yüksek hızlı vakumla (Labconco) kurutulur. Düşük bolluklu CSF proteininin sinyalini arttırmak için, her numuneden 125 ul birleştirerek, her tekrarlı analiz için "geliştirilmiş" bir numune hazırlandı (yani, araştırma numunesini taklit eden bir biyolojik numune, ancak mevcut miktar şu şekildedir: çok daha büyük (37, 69)] karışık bir CSF numunesi (17) halinde birleştirildi. Karışık numune daha sonra 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Giderme Reçinesi (Thermo Fisher Scientific, A36372) kullanılarak bağışıklığı giderildi, yukarıda açıklandığı gibi sindirildi ve sonraki çoklu TMT etiketlemesine dahil edildi.
Gönderim zamanı: Ağu-27-2021