Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan oluşturacağız.
Termofiller yüksek sıcaklıklarda gelişen mikroorganizmalardır. Bunları incelemek, yaşamın aşırı koşullara nasıl uyum sağladığı konusunda değerli bilgiler sağlayabilir. Ancak geleneksel optik mikroskoplarla yüksek sıcaklık koşullarına ulaşmak zordur. Yerel dirençli elektrikli ısıtmaya dayanan çeşitli ev yapımı çözümler önerilmiştir, ancak basit bir ticari çözüm yoktur. Bu yazıda, kullanıcının ortamını yumuşak tutarken termofil çalışmaları için yüksek sıcaklıklar sağlamak üzere mikroskop görüş alanı üzerinde mikro ölçekli lazer ısıtma konseptini tanıtıyoruz. Orta derecede lazer yoğunluğunda mikro ölçekli ısıtma, biyolojik olarak uyumlu ve verimli bir ışık emici olarak altın nanopartikül kaplı bir alt tabaka kullanılarak elde edilebilir. Mikro ölçekli sıvı taşınımının, hücre tutulmasının ve merkezkaç termoforetik hareketin olası etkileri tartışılmaktadır. Yöntem iki türde gösterilmiştir: (i) Mikro ölçekli ısıtma altında çimlendiğini, büyüdüğünü ve yüzdüğünü gözlemlediğimiz, yaklaşık 65°C'de üreyen aktif bir termofilik bakteri olan Geobacillus stearothermophilus; (ii) Optimum derecede hipertermofilik bir arke olan Thiobacillus sp. 80°C'de. Bu çalışma, modern ve uygun fiyatlı mikroskopi araçlarını kullanarak termofilik mikroorganizmaların basit ve güvenli bir şekilde gözlemlenmesinin yolunu açıyor.
Milyarlarca yıl boyunca Dünya'daki yaşam, bazen insan bakış açımıza göre aşırı kabul edilen çok çeşitli çevresel koşullara uyum sağlayacak şekilde gelişti. Özellikle termofil adı verilen bazı termofilik mikroorganizmalar (bakteri, arke, mantar) 45°C ila 122°C1, 2, 3, 4 sıcaklık aralığında gelişirler. Termofiller derin deniz hidrotermal menfezleri, kaplıcalar gibi çeşitli ekosistemlerde yaşarlar. veya volkanik alanlar. Araştırmaları son birkaç on yılda en az iki nedenden dolayı büyük ilgi uyandırdı. Öncelikle onlardan, örneğin termofillerin (5, 6), enzimlerin (7, 8) ve membranların (9) bu kadar yüksek sıcaklıklarda nasıl stabil olduklarını veya termofillerin aşırı radyasyon seviyelerine nasıl dayanabildiğini öğrenebiliriz10. İkincisi, yakıt üretimi13,14,15,16, kimyasal sentez (dihidro, alkoller, metan, amino asitler vb.)17, biyomadencilik18 ve termostabil biyokatalizörler7 ,11 gibi birçok önemli biyoteknolojik uygulamanın1,11,12 temelini oluştururlar. 13. Özellikle, şu anda iyi bilinen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)19, keşfedilen ilk termofillerden biri olan termofilik bakteri Thermus Aquacusus'tan izole edilen bir enzimi (Taq polimeraz) içerir.
Ancak termofillerin incelenmesi kolay bir iş değildir ve herhangi bir biyolojik laboratuvarda doğaçlama yapılamaz. Özellikle, canlı termofiller herhangi bir standart ışık mikroskobu ile, genellikle 40°C kadar düşük sıcaklıklar için derecelendirilen ticari olarak temin edilebilen ısıtma odaları ile bile in vitro gözlemlenemez. 1990'lardan bu yana yalnızca birkaç araştırma grubu kendilerini yüksek sıcaklık mikroskobu (HTM) sistemlerinin tanıtımına adadı. 1994 yılında Glukh ve ark. Isıtma/soğutma odası, anaerobikliği (20) korumak için kapatılan dikdörtgen kılcal damarların sıcaklığını kontrol eden bir Peltier hücresinin kullanımına dayanarak tasarlandı. Cihaz, 2 °C/s'lik bir hızla 100 °C'ye kadar ısıtılabilir, bu da yazarların hipertermofilik bakteri Thermotoga maritima21'in hareketliliğini incelemesine olanak tanır. 1999'da Horn ve ark. Hala hücre bölünmesini/bağlantısını incelemek için ticari mikroskopi için uygun ısıtılmış kılcal damarların kullanımına dayanan çok benzer bir cihaz geliştirildi. Uzun bir göreceli hareketsizlik döneminden sonra, etkili HTM'lerin arayışı, özellikle Horn ve diğerleri tarafından icat edilen bir cihazı kullanan Wirth grubunun bir dizi makalesiyle bağlantılı olarak 2012'de yeniden başladı. On beş yıl önce, hipertermofiller de dahil olmak üzere çok sayıda arkeanın hareketliliği, ısıtılmış kılcal damarlar23,24 kullanılarak 100°C'ye kadar sıcaklıklarda çalışıldı. Ayrıca orijinal mikroskobu daha hızlı ısıtma (ayarlanan sıcaklığa ulaşmak için 35 dakika yerine birkaç dakika) elde etmek ve ortam boyunca 2 cm'den fazla doğrusal bir sıcaklık gradyanı elde etmek için değiştirdiler. Bu sıcaklık gradyanı şekillendirme cihazı (TGFD), biyolojik olarak ilgili mesafelerde 24, 25 sıcaklık gradyanları içinde birçok termofilin hareketliliğini incelemek için kullanılmıştır.
Canlı termofilleri gözlemlemenin tek yolu kapalı kılcal damarları ısıtmak değildir. 2012 yılında Kuwabara ve ark. Isıya dayanıklı yapıştırıcı (Super X2; Cemedine, Japonya) ile kapatılmış ev yapımı tek kullanımlık Pyrex bölmeleri kullanıldı. Numuneler, 110°C'ye kadar ısıtma kapasitesine sahip, ancak orijinal olarak biyogörüntüleme amaçlı olmayan, ticari olarak temin edilebilen şeffaf bir ısıtma plakası (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonya) üzerine yerleştirildi. Yazarlar, 65°C'de anaerobik termofilik bakterilerin (Thermosipho globiformans, iki katına çıkma süresi 24 dakika) verimli bir şekilde bölündüğünü gözlemlediler. 2020'de Pulshen ve ark. Ticari metal tabakların (AttofluorTM, Thermofisher) verimli şekilde ısıtıldığı, iki ev yapımı ısıtma elemanı kullanılarak gösterilmiştir: bir kapak ve bir tabla (PCR makinesinden ilham alan konfigürasyon). Bu birleşme, eşit bir sıvı sıcaklığı sağlar ve kapağın alt kısmında buharlaşmayı ve yoğunlaşmayı önler. O-ring kullanımı çevreyle gaz alışverişini önler. Sulfoskop adı verilen bu HTM, Sulfolobus acidocaldarius'u 75°C'de görüntülemek için kullanıldı27.
Tüm bu sistemlerin tanınmış bir sınırlaması, hava hedeflerinin kullanımına ilişkin kısıtlamaydı; herhangi bir yağa batırma, bu kadar yüksek sıcaklık ve> 1 mm kalınlığındaki şeffaf numuneler aracılığıyla görüntüleme için uygun değildi. Tüm bu sistemlerin tanınmış bir sınırlaması, hava hedeflerinin kullanımına ilişkin kısıtlamaydı; herhangi bir yağa batırma, bu kadar yüksek sıcaklık ve> 1 mm kalınlığındaki şeffaf numuneler aracılığıyla görüntüleme için uygun değildi. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, ку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температуры ve для визуализации через рачные образцы толщиной > 1 mm. Tüm bu sistemlerin bilinen bir eksikliği, herhangi bir yağa batırma işleminin bu kadar yüksek sıcaklık için ve > 1 mm kalınlığındaki şeffaf numuneler aracılığıyla görselleştirme için uygun olmaması nedeniyle, hava hedeflerinin kullanımının sınırlandırılmasıydı.1毫米厚的透明样品成像。 Tüm bu sistemlerin tanınmış bir sınırlaması, hava sürüklenen bir ayna kullanmanın sınırlamasıdır, çünkü herhangi bir yağa batırma, bu kadar yüksek sıcaklıklarda> 1 mm kalınlığındaki şeffaf numunelerin görüntülenmesi için uygun değildir. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, иммерсионное погружение в масло непригодно для таких высоких sıcaklık ve визуализации через обрачные ы толщиной >1 mm. Tüm bu sistemlerin kabul edilen bir dezavantajı, hava lenslerinin sınırlı kullanımıdır; herhangi bir yağa batırma, bu tür yüksek sıcaklıklar için uygun değildir ve> 1 mm kalınlığındaki şeffaf numuneler aracılığıyla görselleştirmedir.Daha yakın zamanlarda bu sınırlama Charles-Orzag ve ark. tarafından kaldırıldı. 28, artık ilgilenilen sistemin çevresine ısı sağlamayan, bunun yerine kapak camının içinde, ITO'dan (indiyum-kalay oksit) yapılmış ince şeffaf bir direnç tabakasıyla kaplanmış bir cihaz geliştirdi. Kapak, şeffaf katmandan elektrik akımı geçirilerek 75 °C'ye kadar ısıtılabilmektedir. Bununla birlikte, yazarın ayrıca merceği objektife kadar ısıtması gerekir, ancak buna zarar vermemek için 65 °C'den fazla olmamalıdır.
Bu çalışmalar, verimli yüksek sıcaklık optik mikroskopisinin geliştirilmesinin geniş çapta benimsenmediğini, sıklıkla ev yapımı ekipman gerektirdiğini ve sıklıkla uzaysal çözünürlük pahasına elde edildiğini göstermektedir; bu, termofilik mikroorganizmaların birkaç taneden daha büyük olmadığı göz önüne alındığında ciddi bir dezavantajdır. mikrometre. Azaltılmış ısıtma hacmi, HTM'nin üç doğal sorununu çözmenin anahtarıdır: zayıf uzaysal çözünürlük, sistem ısındığında yüksek termal atalet ve aşırı sıcaklıklarda çevredeki elemanların (immersiyon yağı, objektif mercek... veya kullanıcının elleri) zararlı şekilde ısınması. ).
Bu yazıda, dirençli ısıtmaya dayanmayan termofil gözlemi için bir HTM tanıtıyoruz. Bunun yerine, ışığı emen bir alt tabakanın lazerle ışınlanmasıyla mikroskobun görüş alanının sınırlı bir bölgesinde lokal ısıtma elde ettik. Sıcaklık dağılımı kantitatif faz mikroskobu (QPM) kullanılarak görselleştirildi. Bu yöntemin etkinliği, yaklaşık 65°C'de üreyen ve kısa bir iki katına çıkma süresine (yaklaşık 20 dakika) sahip, hareketli bir termofilik bakteri olan Geobacillus stearothermophilus ve 80°C'de (archaea) optimum şekilde büyüyen bir hipertermofil olan Sulfolobus shibatae tarafından kanıtlanmıştır. örneklendirmek için. Sıcaklığın bir fonksiyonu olarak normal replikasyon oranı ve yüzme gözlendi. Bu lazer HTM (LA-HTM), lamel kalınlığı veya objektifin doğası (hava veya yağa daldırma) ile sınırlı değildir. Bu, piyasadaki herhangi bir yüksek çözünürlüklü lensin kullanılmasına olanak tanır. Ayrıca termal atalet nedeniyle yavaş ısınma sorunu yaşamaz (milisaniye ölçeğinde anında ısıtma sağlar) ve yalnızca ticari olarak temin edilebilen bileşenleri kullanır. Yeni güvenlik endişeleri, cihazın içinde ve muhtemelen koruyucu gözlük gerektiren gözler yoluyla güçlü lazer ışınlarının (tipik olarak 100 mW'a kadar) varlığıyla ilgilidir.
LA-HTM'nin prensibi, mikroskobun görüş alanı içinde numuneyi lokal olarak ısıtmak için bir lazer kullanmaktır (Şekil 1a). Bunu yapmak için numunenin ışığı emici olması gerekir. Makul bir lazer gücü kullanmak için (100 mW'den az), ışığın sıvı ortam tarafından emilmesine güvenmedik, ancak alt tabakayı altın nanopartiküller ile kaplayarak numunenin emilimini yapay olarak arttırdık (Şekil 1c). Altın nanopartiküllerinin ışıkla ısıtılması, biyotıp, nanokimya veya güneş ışığı hasadında beklenen uygulamalarla termal plazmonik alanında temel öneme sahiptir29,30,31. Geçtiğimiz birkaç yılda bu LA-HTM'yi fizik, kimya ve biyolojideki termal plazma uygulamalarıyla ilgili çeşitli çalışmalarda kullandık. Bu yöntemin ana zorluğu, yüksek sıcaklığın numune içindeki mikro ölçekli bir bölgeyle sınırlı olması nedeniyle nihai sıcaklık profilinin görüntülenmesidir. Sıcaklık haritalamasının, iki boyutlu kırınım ızgaralarının (çapraz ızgaralar olarak da bilinir) kullanımına dayanan basit, yüksek çözünürlüklü ve çok hassas bir kantitatif faz mikroskobu yöntemi olan dört dalga boyu enine kesme interferometresi ile elde edilebileceğini gösterdik. 33,34,35,36. Çapraz ızgaralı dalga cephesi mikroskobuna (CGM) dayanan bu termal mikroskopi tekniğinin güvenilirliği, son on yılda yayınlanan bir düzine makalede gösterilmiştir37,38,39,40,41,42,43.
Paralel lazer ısıtma, şekillendirme ve sıcaklık mikroskobunun kurulum şeması. b Altın nanopartiküllerle kaplanmış bir lamel içeren bir AttofluorTM bölmesinden oluşan numune geometrisi. c Örneğe yakından bakın (ölçeklendirmeden). d, tek biçimli lazer ışını profilini ve (e) altın nanopartiküllerin numune düzleminde simüle edilmiş sonraki sıcaklık dağılımını temsil eder. f, (g)'de gösterilen sonuçta ortaya çıkan sıcaklık dağılımının simülasyonunda gösterildiği gibi, tekdüze bir sıcaklık oluşturmaya uygun halka şeklinde bir lazer ışını profilidir. Ölçek çubuğu: 30 µm.
Özellikle, yakın zamanda memeli hücrelerinin LA-HTM ve CGM ile ısıtılmasını sağladık ve 37-42°C aralığında hücresel ısı şoku yanıtlarını takip ederek bu tekniğin tek canlı hücre görüntülemeye uygulanabilirliğini gösterdik. Bununla birlikte, LA-HTM'nin yüksek sıcaklıklardaki mikroorganizmaların incelenmesinde uygulanması kesin değildir çünkü memeli hücrelerine kıyasla daha fazla dikkat gerektirir: ilk olarak ortamın tabanının (birkaç derece yerine) onlarca derece ısıtılması, güçlü bir dikey sıcaklık gradyanına. alt tabakaya sıkıca bağlanmadığı takdirde istenmeyen hareketlere ve bakterilerin karışmasına neden olabilen sıvı taşınımı (44) yaratabilir. Bu konveksiyon, sıvı katmanın kalınlığının azaltılmasıyla ortadan kaldırılabilir. Bu amaçla aşağıda sunulan tüm deneylerde, metal bir kap (AttofluorTM, Thermofisher, Şekil 1b,c) içine yerleştirilen yaklaşık 15 µm kalınlığındaki iki lamel arasına bakteri süspansiyonları yerleştirildi. Prensip olarak, sıvının kalınlığı ısıtma lazerinin ışın boyutundan küçükse konveksiyon önlenebilir. İkinci olarak, bu kadar sınırlı bir geometride çalışmak aerobik organizmaları boğabilir (bkz. Şekil S2). Bu sorun, oksijeni (veya diğer herhangi bir hayati gazı) geçirebilen bir alt tabaka kullanılarak, lamel içinde sıkışmış hava kabarcıkları bırakılarak veya üst lamelde delikler açılarak önlenebilir (bkz. Şekil S1) 45. Bu çalışmada ikinci çözümü seçtik (Şekil 1b ve S1). Son olarak, lazerle ısıtma düzgün sıcaklık dağılımı sağlamaz. Lazer ışınının aynı yoğunluğunda bile (Şekil 1d), sıcaklık dağılımı tekdüze değildir, aksine termal difüzyon nedeniyle Gauss dağılımına benzemektedir (Şekil 1e). Amaç, biyolojik sistemleri incelemek için görüş alanında kesin sıcaklıklar oluşturmak olduğunda, eşit olmayan profiller ideal değildir ve ayrıca substrata yapışmazlarsa bakterilerin termoforetik hareketine de yol açabilir (bkz. Şekil S3, S4)39. Bu amaçla, belirli bir geometrik alan içinde mükemmel şekilde düzgün bir sıcaklık dağılımı elde etmek amacıyla kızılötesi lazer ışınını numune düzlemindeki halkanın şekline (Şekil 1f) göre şekillendirmek için bir uzaysal ışık modülatörü (SLM) kullandık. termal difüzyona rağmen (Şekil 1d) 39, 42, 46. Ortamın buharlaşmasını önlemek için metal bir tabak (Şekil 1b) üzerine bir üst lamel yerleştirin ve en az birkaç gün gözlemleyin. Bu üst lamel kapatılmadığından, gerektiğinde herhangi bir zamanda ilave ortam kolaylıkla eklenebilir.
LA-HTM'nin nasıl çalıştığını göstermek ve termofilik araştırmalarda uygulanabilirliğini göstermek için, optimum büyüme sıcaklığı yaklaşık 60-65°C olan aerobik bakteri Geobacillus stearothermophilus üzerinde çalıştık. Bakterinin ayrıca kamçısı ve yüzme yeteneği de vardır, bu da normal hücresel aktivitenin başka bir göstergesidir.
Numuneler (Şekil lb) 60°C'de bir saat süreyle ön inkübasyona tabi tutuldu ve ardından bir LA-HTM numune tutucusuna yerleştirildi. Bu ön inkübasyon isteğe bağlıdır, ancak iki nedenden dolayı yine de faydalıdır: Birincisi, lazer açıldığında hücrelerin hemen büyümesine ve bölünmesine neden olur (Ek Malzemeler'deki M1 filmine bakın). Ön inkübasyon olmadan, numune üzerinde yeni bir görüntüleme alanının her ısıtılmasında bakteriyel büyüme tipik olarak yaklaşık 40 dakika geciktirilir. İkincisi, 1 saatlik ön inkübasyon, bakterilerin lamellere yapışmasını destekleyerek, lazer açıldığında hücrelerin termoforez nedeniyle görüş alanından dışarı çıkmasını önledi (Ek Malzemeler'deki M2 filmine bakın). Termoforez, parçacıkların veya moleküllerin genellikle sıcaktan soğuğa doğru bir sıcaklık gradyanı boyunca hareketidir ve bakteriler de istisna değildir43,47. Bu istenmeyen etki, lazer ışınını şekillendirmek ve düz bir sıcaklık dağılımı elde etmek için SLM kullanılarak belirli bir alan üzerinde ortadan kaldırılır.
Şek. Şekil 2, altın nanopartiküllerle kaplanmış bir cam substratın halka şeklinde bir lazer ışınıyla ışınlanmasıyla elde edilen CGM tarafından ölçülen sıcaklık dağılımını gösterir (Şekil 1f). Lazer ışınının kapladığı alanın tamamında düz bir sıcaklık dağılımı gözlendi. Bu bölge, optimum büyüme sıcaklığı olan 65°C'ye ayarlandı. Bu bölgenin dışında, sıcaklık eğrisi doğal olarak \(1/r\)'ye düşer (burada \(r\) radyal koordinattır).
Dairesel bir alan üzerinde düz bir sıcaklık profili elde etmek için bir altın nanopartikül tabakasını ışınlamak üzere halka şeklinde bir lazer ışını kullanılarak elde edilen CGM ölçümlerinin Sıcaklık haritası. b Sıcaklık haritasının (a) izotermi. Lazer ışınının konturu gri noktalı bir daire ile temsil edilir. Deney iki kez tekrarlandı (bkz. Ek Malzemeler, Şekil S4).
Bakteri hücrelerinin canlılığı LA-HTM kullanılarak birkaç saat boyunca izlendi. Şek. Şekil 3, 3 saat 20 dakikalık bir filmden alınan dört görüntünün zaman aralığını gösterir (Film M3, Ek Bilgiler). Sıcaklığın optimal olduğu ve 65°C'ye yaklaştığı lazer tarafından tanımlanan dairesel alan içerisinde bakterilerin aktif olarak çoğaldığı gözlemlendi. Buna karşılık sıcaklık 10 saniye boyunca 50°C'nin altına düştüğünde hücre büyümesi önemli ölçüde azaldı.
Farklı zamanlarda lazer ısıtma sonrasında büyüyen G. stearothermophilus bakterisinin optik derinlik görüntüleri, (a) t = 0 dk, (b) 1 saat 10 dk, (c) 2 saat 20 dk, (d) 3 saat 20 dk, 200 İlgili sıcaklık haritasının üzerine yerleştirilmiş bir dakikalık bir filmden (Ek Bilgilerde sağlanan M3 filmi) alıntılanmıştır. Lazer \(t=0\) zamanında açılır. Yoğunluk görüntüsüne izotermler eklendi.
Hücre büyümesini ve bunun sıcaklığa bağımlılığını daha fazla ölçmek için, Movie M3 görüş alanında başlangıçta izole edilen çeşitli bakteri kolonilerinin biyokütlesindeki artışı ölçtük (Şekil 4). Mini koloni oluşturan birim (mCFU) oluşumunun başlangıcında seçilen ana bakteriler Şekil S6'da gösterilmektedir. Sıcaklık dağılımını haritalamak için kullanılan CGM 48 kamera ile kuru kütle ölçümleri alınmıştır. CGM'nin kuru ağırlığı ve sıcaklığı ölçebilme yeteneği LA-HTM'nin gücüdür. Beklendiği gibi, yüksek sıcaklık daha hızlı bakteri üremesine neden oldu (Şekil 4a). Şekil 4b'deki yarı log grafiğinde gösterildiği gibi, tüm sıcaklıklarda büyüme üstel büyümeyi takip eder; burada veriler \(m={m_{0}{10}^{t/\ tau }+ üstel fonksiyonunu kullanır {{ \mbox{cst}}}\), burada \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – nesil süresi (veya iki katına çıkma süresi), \( g =1/ \tau\) – büyüme oranı (birim zamandaki bölüm sayısı). Şek. Şekil 4c, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak ilgili büyüme hızını ve üretim süresini gösterir. Hızlı büyüyen mCFU'lar, yüksek bakteri yoğunluğu nedeniyle beklenen bir davranış olan (klasik sıvı kültürlerdeki sabit faza benzer), iki saat sonra büyümenin doyması ile karakterize edilir. Genel şekil \(g\left(T\right)\) (Şekil 4c), 60-65°C civarında optimal büyüme oranıyla G. stearothermophilus için beklenen iki fazlı eğriye karşılık gelir. Verileri bir kardinal model kullanarak eşleştirin (Şekil S5)49 burada \(\left({{G}__{0}{;\;T}__{{\min }};{T__{{opt} } ;{T__{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, bu da literatürde belirtilen diğer değerlerle oldukça uyumludur49. Sıcaklığa bağlı parametreler tekrarlanabilir olmasına rağmen, \({G_{0}\)'nin maksimum büyüme hızı bir deneyden diğerine değişebilir (bkz. Şekiller S7-S9 ve M4 filmi). Evrensel olması gereken sıcaklık uyum parametrelerinin aksine, maksimum büyüme hızı, gözlemlenen mikro ölçekli geometri içindeki ortamın özelliklerine (besinlerin mevcudiyeti, oksijen konsantrasyonu) bağlıdır.
a Çeşitli sıcaklıklarda mikrobiyal büyüme. mCFU: Minyatür Koloni Oluşturma Birimleri. Sıcaklık gradyanında büyüyen tek bir bakterinin videosundan elde edilen veriler (M3 filmi). b (a) ile aynı, yarı logaritmik ölçek. c Büyüme hızı\(\tau\) ve nesil süresi\(g\) doğrusal regresyondan (b) hesaplanır. Yatay hata çubukları: Büyüme sırasında mCFU'ların görüş alanına genişlediği sıcaklık aralığı. Dikey hata çubukları: doğrusal regresyon standart hatası.
Normal büyümeye ek olarak, lazerle ısıtma sırasında bazı bakteriler bazen görüş alanına giriyordu; bu, kamçılı bakteriler için beklenen bir davranıştı. Ek bilgilerdeki M5 filmi bu tür yüzme aktivitelerini göstermektedir. Bu deneyde, Şekil 1d, e ve S3'te gösterildiği gibi bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için tekdüze lazer radyasyonu kullanıldı. Şekil 5, bir bakterinin yönsel hareket sergilerken diğer tüm bakterilerin hareketsiz kaldığını gösteren M5 filminden seçilen iki görüntü dizisini göstermektedir.
İki zaman dilimi (a) ve (b), noktalı dairelerle işaretlenmiş iki farklı bakterinin yüzmesini göstermektedir. Görüntüler M5 filminden alınmıştır (ek materyal olarak sağlanmıştır).
G. stearothermophilus durumunda bakterilerin aktif hareketi (Şekil 5), lazer ışınının açılmasından birkaç saniye sonra başladı. Bu gözlem, Mora ve ark. tarafından daha önce gözlemlendiği gibi, bu termofilik mikroorganizmanın sıcaklıktaki artışa karşı geçici tepkisini vurgulamaktadır. 24. Bakteriyel hareketlilik ve hatta termotaksi konusu LA-HTM kullanılarak daha da araştırılabilir.
Mikrobiyal yüzme diğer fiziksel hareket türleri ile karıştırılmamalıdır, yani (i) belirli bir yönü olmayan kaotik bir hareket gibi görünen Brown hareketi, (ii) bir sıcaklık boyunca düzenli bir hareket kaymasından oluşan konveksiyon 50 ve termoforez 43 degrade.
G. stearothermophilus, bir savunma olarak olumsuz çevre koşullarına maruz kaldığında oldukça dirençli sporlar (spor oluşumu) üretme yeteneğiyle bilinir. Çevresel koşullar tekrar uygun hale geldiğinde sporlar çimlenir, canlı hücreler oluşturur ve büyümeye devam eder. Bu sporlanma/çimlenme süreci iyi bilinmesine rağmen hiçbir zaman gerçek zamanlı olarak gözlemlenmemiştir. LA-HTM'yi kullanarak burada G. stearothermophilus'taki çimlenme olaylarının ilk gözlemini rapor ediyoruz.
Şek. Şekil 6a, 13 spordan oluşan bir CGM seti kullanılarak elde edilen optik derinliğin (OT) hızlandırılmış görüntülerini gösterir. Toplama süresinin tamamı boyunca (15 saat 6 dakika, \(t=0\) – lazer ısıtmanın başlangıcı), 13 spordan 4'ü birbirini izleyen \(t=2\) saat, \( 3\ zaman noktalarında çimlendi. ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' ve \(11\) h \(30\)'. Şekil 6'da bu olaylardan sadece biri gösterilse de ek materyalde yer alan M6 filminde 4 çimlenme olayı gözlemlenebilmektedir. İlginç bir şekilde çimlenme rastgele görünüyor: Çevre koşullarındaki aynı değişikliklere rağmen sporların tümü çimlenmiyor ve aynı anda çimlenmiyor.
8 OT görüntüsünden (yağ daldırma, 60x, 1,25 NA hedefi) ve (b) G. stearothermophilus agregatlarının biyokütle evriminden oluşan hızlandırılmış bir çekim. c (b) Büyüme oranının doğrusallığını vurgulamak için yarı logaritmik ölçekte çizilmiştir (kesikli çizgi).
Şek. Şekil 6b,c, tüm veri toplama süresi boyunca zamanın bir fonksiyonu olarak görüş alanındaki hücre popülasyonlarının biyokütlesini gösterir. Şekil 2'de \(t=5\)h'de gözlemlenen kuru kütlenin hızlı bozunması. 6b, c, bazı hücrelerin görüş alanından çıkması nedeniyle. Bu dört olayın büyüme hızı \(0,77\pm 0,1\) h-1'dir. Bu değer, hücrelerin normal şekilde büyüdüğü Şekil 3.3 ve 4'te gösterilen büyüme oranından daha yüksektir. G. stearothermophilus'un sporlardan artan büyüme oranının nedeni belirsizdir, ancak bu ölçümler LA-HTM'nin ilgisini vurgulamaktadır ve hücre yaşamının dinamikleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için tek hücre düzeyinde (veya tek mCFU düzeyinde) çalışmaktadır. .
LA-HTM'nin çok yönlülüğünü ve yüksek sıcaklıklardaki performansını daha da göstermek için, optimum büyüme sıcaklığı 80°C51 olan hipertermofilik asidofilik bir arke olan Sulfolobus shibatae'nin büyümesini inceledik. G. stearothermophilus ile karşılaştırıldığında bu arkeler ayrıca çok farklı bir morfolojiye sahiptir; uzun çubuklardan (basil) ziyade 1 mikronluk kürelere (koklar) benzerler.
Şekil 7a, CGM kullanılarak elde edilen S. shibatae mCFU'nun sıralı optik derinlik görüntülerinden oluşur (Ek Malzemeler'deki M7 uzun metrajlı filmine bakınız). Bu mCFU, 80°C'lik optimum sıcaklığın altında, ancak aktif büyüme için sıcaklık aralığı dahilinde, yaklaşık 73°C'de büyür. Birkaç saat sonra mCFU'ların arkea mikrograflarına benzemesine neden olan çok sayıda fisyon olayı gözlemledik. Bu OT görüntülerinden mCFU biyokütlesi zaman içinde ölçüldü ve Şekil 7b'de sunuldu. İlginç bir şekilde S. shibatae mCFU'ları, G. stearothermophilus mCFU'larında görülen üstel büyüme yerine doğrusal büyüme gösterdi. Hücre büyüme oranlarının doğası hakkında uzun süredir devam eden bir tartışma 52 vardır: Bazı çalışmalar mikropların boyutlarıyla orantılı büyüme hızlarını bildirirken (üstel büyüme), diğerleri ise sabit bir oran (doğrusal veya çift doğrusal büyüme) göstermektedir. Tzur ve ark.53 tarafından açıklandığı gibi, üstel ve (bi)doğrusal büyüme arasında ayrım yapmak, biyokütle ölçümlerinde <%6'lık bir hassasiyet gerektirir; bu, interferometriyi de içeren çoğu QPM tekniği için erişilemez bir durumdur. Tzur ve ark.53 tarafından açıklandığı gibi, üstel ve (bi)doğrusal büyüme arasında ayrım yapmak, biyokütle ölçümlerinde <%6'lık bir hassasiyet gerektirir; bu, interferometriyi de içeren çoğu QPM tekniği için erişilemez bir durumdur. Mayıs ayında ve 53'te, en düşük seviyedeki krediler <%6'da kaldı биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Zur ve ark.53 tarafından açıklandığı gibi, üstel ve (bi)doğrusal büyüme arasında ayrım yapmak, biyokütle ölçümlerinde <%6 doğruluk gerektirir; bu, çoğu QPM yöntemi için, interferometri kullanıldığında bile elde edilemez.Zur ve ark. Şekil 53'e göre, üstel ve (bi)doğrusal büyüme arasında ayrım yapmak, biyokütle ölçümlerinde %6'dan daha az doğruluk gerektirir; bu, interferometri kullanıldığında bile çoğu QPM yöntemi için elde edilemez. CGM, bu doğruluğu biyokütle ölçümlerinde pg altı doğrulukla elde eder36,48.
6 OT görüntüsünden (yağ daldırma, 60x, NA hedefi 1.25) ve (b) CGM ile ölçülen mikro-CFU biyokütle evriminden oluşan hızlandırılmış bir çekim. Daha fazla bilgi için M7 filmine bakın.
S. shibatae'nin mükemmel doğrusal büyümesi beklenmedik bir durumdu ve henüz rapor edilmedi. Bununla birlikte, en azından zamanla 2, 4, 8, 16 hücrelik çoklu bölünmelerin meydana gelmesi gerektiğinden üstel büyüme bekleniyor. Hücre yoğunluğunun çok yüksek olması durumunda hücre büyümesinin yavaşlaması ve sonunda uyku durumuna ulaşması gibi, doğrusal büyümenin de yoğun hücre paketlenmesinden kaynaklanan hücre inhibisyonundan kaynaklanabileceğini varsaydık.
Sırayla aşağıdaki beş ilgi çekici noktayı tartışarak sonuca varıyoruz: ısıtma hacminde azalma, termal atalette azalma, altın nanopartiküllerine ilgi, kantitatif faz mikroskobuna ilgi ve LA-HTM'nin kullanılabileceği olası bir sıcaklık aralığı.
Dirençli ısıtma ile karşılaştırıldığında, HTM geliştirme için kullanılan lazer ısıtma, bu çalışmada gösterdiğimiz çeşitli avantajlar sunmaktadır. Özellikle mikroskobun görüş alanındaki sıvı ortamda ısıtma hacmi birkaç (10 μm) 3 hacim dahilinde tutulur. Bu şekilde, yalnızca gözlemlenen mikroplar aktif olurken diğer bakteriler hareketsiz kalır ve numuneyi daha fazla incelemek için kullanılabilir; yeni bir sıcaklığın kontrol edilmesi gerektiğinde numuneyi değiştirmeye gerek yoktur. Ek olarak, mikro ölçekli ısıtma, geniş bir sıcaklık aralığının doğrudan incelenmesine olanak tanır: Şekil 4c, genellikle birkaç numunenin (çalışılan numunelerin her biri için bir tane) hazırlanmasını ve incelenmesini gerektiren 3 saatlik bir filmden (Film M3) elde edilmiştir. y, deneydeki gün sayısını temsil eden sıcaklıktır. Isıtılan hacmin azaltılması aynı zamanda mikroskobun çevredeki tüm optik bileşenlerini, özellikle de objektif merceğini oda sıcaklığında tutar; bu da şimdiye kadar topluluğun karşılaştığı büyük bir sorun olmuştur. LA-HTM, yağlı lensler de dahil olmak üzere herhangi bir lensle kullanılabilir ve görüş alanındaki aşırı sıcaklıklarda bile oda sıcaklığında kalacaktır. Bu çalışmada rapor ettiğimiz lazer ısıtma yönteminin ana sınırlaması, yapışmayan veya yüzmeyen hücrelerin görüş alanından uzak olması ve incelenmesinin zor olabilmesidir. Birkaç yüz mikronu aşan daha büyük bir sıcaklık artışı elde etmek için düşük büyütmeli merceklerin kullanılması geçici bir çözüm olabilir. Bu uyarıya uzaysal çözünürlükte bir azalma eşlik eder, ancak amaç mikroorganizmaların hareketini incelemekse yüksek uzaysal çözünürlüğe gerek yoktur.
Sistemin ısıtılması (ve soğutulması) için zaman ölçeği \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}__{{{\mbox{D}}}}\) boyutuna bağlıdır , yasaya göre \({{{({\rm{\tau }}}}}}__{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), burada \ (L\ ) ısı kaynağının karakteristik boyutudur (çalışmamızdaki lazer ışınının çapı \(L\ yaklaşık 100\) μm'dir), \(D\) ortamın termal yayılımıdır (bizim çalışmamızdaki ortalama). kasa, cam ve su Difüzyon hızı\(D\ yaklaşık 2\kat {10}^{-7}\) m2/s). Bu nedenle, bu çalışmada 50 ms düzeyinde, yani yarı anlık zaman yanıtları. Sıcaklık artışının bu anlık oluşumu yalnızca deneyin süresini kısaltmakla kalmaz, aynı zamanda sıcaklık etkilerinin herhangi bir dinamik çalışması için kesin zamanlamaya (t=0\) olanak tanır.
Önerilen yöntemimiz herhangi bir ışık emici alt tabakaya (örneğin, ITO kaplamalı ticari numuneler) uygulanabilir. Bununla birlikte, altın nanopartikülleri, kızılötesinde yüksek absorpsiyon ve görünür aralıkta düşük absorpsiyon sağlayabilmektedir; bu sonuncu özellikler, özellikle floresans kullanıldığında görünür aralıkta etkili optik gözlem için ilgi çekicidir. Ayrıca altın biyouyumludur, kimyasal olarak inerttir, optik yoğunluk 530 nm'den yakın kızılötesine kadar ayarlanabilir ve numune hazırlama basit ve ekonomiktir29.
Enine ızgaralı dalga cephesi mikroskobu (CGM), yalnızca mikro ölçekte sıcaklık haritalamasına değil, aynı zamanda biyokütle izlemesine de olanak tanır, bu da onu LA-HTM ile kombinasyon halinde (gerekli değilse) özellikle yararlı kılar. Son on yılda, özellikle biyogörüntüleme alanında başka sıcaklık mikroskobu teknikleri geliştirildi ve bunların çoğu sıcaklığa duyarlı floresan probların54,55 kullanılmasını gerektiriyor. Bununla birlikte, bu yöntemler eleştirildi ve bazı raporlar, muhtemelen floresansın sıcaklıktan başka birçok faktöre bağlı olması nedeniyle hücreler içindeki gerçekçi olmayan sıcaklık değişikliklerini ölçtü. Ayrıca çoğu floresan prob yüksek sıcaklıklarda kararsızdır. Bu nedenle, QPM ve özellikle CGM, optik mikroskopi kullanılarak yüksek sıcaklıklardaki yaşamı incelemek için ideal bir sıcaklık mikroskobu tekniğini temsil eder.
İdeal olarak 80°C'de yaşayan S. shibatae üzerinde yapılan çalışmalar, LA-HTM'nin sadece basit termofiller için değil, hipertermofiller için de uygulanabileceğini göstermektedir. Prensip olarak, LA-HTM kullanılarak ulaşılabilecek sıcaklık aralığının bir sınırı yoktur ve 38 kişilik grubumuzun atmosferik basınçtaki hidrotermal kimya uygulamalarında gösterdiği gibi, atmosferik basınçta kaynamadan 100°C'nin üzerindeki sıcaklıklara bile ulaşılabilir. basınç A. Altın nanoparçacıklarını (40) aynı şekilde ısıtmak için bir lazer kullanılır. Dolayısıyla LA-HTM, standart koşullar altında (yani çevresel stres altında) standart yüksek çözünürlüklü optik mikroskopi ile benzeri görülmemiş hipertermofilleri gözlemlemek için kullanılma potansiyeline sahiptir.
Tüm deneyler, Köhler aydınlatması (LED ile, M625L3, Thorlabs, 700 mW), manuel xy hareketine sahip numune tutucusu, objektifler (Olympus, 60x, 0,7 NA, hava, LUCPlanFLN60X veya 60x, 1,25 NA, Yağ) dahil olmak üzere ev yapımı bir mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. , UPLFLN60XOI), yoğunluk ve dalga cephesi görüntüleme sağlamak için CGM kamera (QLSI çapraz ızgara, 39 µm aralık, Andor Zyla kamera sensöründen 0,87 mm) ve görüntüleri kaydetmek için sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16 bit mod, Hamamatsu'dan) Şekil 5'te gösterilen veriler (bakteriyel yüzme). Dikroik ışın ayırıcı, 749 nm'lik bir BrightLine kenarıdır (Semrock, FF749-SDi01). Kameranın ön tarafındaki filtre 694 kısa geçişli bir filtredir (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanyum safir lazer (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pompalı tsunami lazer boşluğu, Şekil 2-5'te Spectra-Physics, ayrıca Millenia lazer ile değiştirilmiştir, Spectraphysics 10 W, pompalı Mira lazer boşluğu, Tutarlı, Şekil 2 için) -5). Şekil 6 ve 7), altın nanopartiküllerinin plazmon rezonans spektrumuna karşılık gelen \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm dalga boyuna ayarlanır. 1152 piksel) Meadowlark Optics'ten satın alınmıştır. Hologramlar, bağlantı 39'da açıklandığı gibi Gerchberg-Saxton algoritması kullanılarak hesaplanmıştır.
Çapraz ızgaralı dalga cephesi mikroskobu (CGM), iki boyutlu bir kırınım ızgarasının (çapraz ızgara olarak da bilinir) geleneksel bir kameranın sensöründen bir milimetre mesafede birleştirilmesine dayanan bir optik mikroskopi tekniğidir. Bu çalışmada kullandığımız en yaygın CGM örneği, dört dalga boyu enine kaydırmalı interferometre (QLSI) olarak adlandırılır; burada çapraz ızgara, Primot ve diğerleri tarafından tanıtılan ve patenti alınan bir yoğunluk/faz dama tahtası deseninden oluşur. 200034'te. Dikey ve yatay ızgara çizgileri, sensör üzerinde ızgara benzeri gölgeler oluşturur; bunların distorsiyonu, gelen ışığın optik dalga cephesi distorsiyonunu (veya eşdeğer faz profilini) elde etmek için gerçek zamanlı olarak sayısal olarak işlenebilmektedir. Bir mikroskop üzerinde kullanıldığında, bir CGM kamera, görüntülenen bir nesnenin optik derinlik (OT) olarak da bilinen optik yol farkını nanometre mertebesinde bir hassasiyetle görüntüleyebilir36. Herhangi bir CGM ölçümünde, optik bileşenler veya ışınlardaki herhangi bir kusuru ortadan kaldırmak için, birincil referans OT görüntüsü alınmalı ve sonraki görüntülerden çıkarılmalıdır.
Referansta açıklandığı gibi bir CGM kamera kullanılarak sıcaklık mikroskobu yapıldı. 32. Kısacası, bir sıvının ısıtılması onun kırılma indisini değiştirerek gelen ışını bozan bir termal mercek etkisi yaratır. Bu dalga cephesi distorsiyonu CGM tarafından ölçülür ve sıvı ortamda üç boyutlu bir sıcaklık dağılımı elde etmek için bir ters evrişim algoritması kullanılarak işlenir. Altın nanoparçacıkları numune boyunca eşit bir şekilde dağılmışsa, daha iyi görüntüler elde etmek için bakteri bulunmayan alanlarda sıcaklık haritalaması yapılabilir ki bu da bazen yaptığımız şeydir. Referans CGM görüntüsü ısıtma olmadan (lazer kapalıyken) elde edildi ve ardından lazer açıkken görüntüdeki aynı konumda yakalandı.
Kuru kütle ölçümü, sıcaklık görüntüleme için kullanılan aynı CGM kamera kullanılarak gerçekleştirilir. CGM referans görüntüleri, bakterilerin varlığına bağlı olarak OT'deki herhangi bir homojensizliğin ortalamasını almanın bir yolu olarak maruz kalma sırasında numunenin x ve y'de hızla hareket ettirilmesiyle elde edildi. Bakterilerin OT görüntülerinden, Matlab'ın ev yapımı segmentasyon algoritması kullanılarak seçilen alanlar üzerindeki bir görüntü topluluğu kullanılarak biyokütleleri elde edildi (bkz. “Sayısal kod” alt bölümü), ref. 48. Kısaca \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} ilişkisini kullanıyoruz } x{{\mbox{d}}}y\), burada \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) optik derinlik görüntüsüdür, \(m\) ise kuru ağırlık ve \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) bir sabittir. Canlı hücreler için tipik bir sabit olan \({{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg'yi seçtik.
Altın nanopartiküller ile kaplanmış 25 mm çapında ve 150 um kalınlığında bir lamel, altın nanopartiküller yukarı bakacak şekilde bir AttofluorTM bölmesine (Thermofisher) yerleştirildi. Geobacillus stearothermophilus, deneylerin her gününden önce LB ortamında (200 rpm, 60°C) gece boyunca önceden kültürlendi. Optik yoğunluğu (OD) 0,3 ila 0,5 olan G. stearothermophilus süspansiyonundan 5 ul'lik bir damla, altın nanopartiküller içeren bir lamel üzerine yerleştirildi. Daha sonra, ortasında 5 mm çapında bir delik bulunan, 18 mm çapında yuvarlak bir lamel damlatıldı ve deliğin merkezine aynı optik yoğunluğa sahip 5 µl bakteri süspansiyonu tekrar tekrar uygulandı. Lamellerdeki kuyucuklar ref'te açıklanan prosedüre uygun olarak hazırlandı. 45 (daha fazla bilgi için Ek Bilgilere bakınız). Daha sonra sıvı katmanın kurumasını önlemek için lamel içerisine 1 ml LB ortamı ekleyin. Son lamel, inkübasyon sırasında ortamın buharlaşmasını önlemek için Attofluor™ bölmesinin kapalı kapağı üzerine yerleştirilir. Çimlenme deneyleri için, geleneksel deneylerden sonra bazen üst lamelleri kaplayan sporları kullandık. Sulfolobus shibatae'yi elde etmek için benzer bir yöntem kullanıldı. Ortam 182'de (DSMZ) Thiobacillus serrata'nın üç günlük (200 rpm, 75°C) ön kültivasyonu gerçekleştirildi.
Altın nanopartikül örnekleri misel blok kopolimer litografi ile hazırlandı. Bu süreç Bölüm 1'de ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. 60. Kısaca, altın iyonlarını kapsülleyen miseller, kopolimerin toluen içindeki HAuCl4 ile karıştırılmasıyla sentezlendi. Temizlenen lameller daha sonra çözeltiye daldırıldı ve altın tohumlar elde etmek için bir indirgeyici madde varlığında UV ışınlaması ile işlendi. Son olarak, altın tohumları, bir lamelin sulu bir KAuCl4 ve etanolamin çözeltisi ile 16 dakika boyunca temas ettirilmesiyle büyütüldü; bu, yakın kızılötesinde küresel olmayan altın nanopartiküllerin yarı periyodik ve çok düzgün bir düzenlemesiyle sonuçlandı.
İnterferogramları OT görüntülerine dönüştürmek için bağlantıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ev yapımı bir algoritma kullandık. 33 ve aşağıdaki halka açık depoda Matlab paketi olarak mevcuttur: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket, kaydedilen interferogramlara (referans görüntüler dahil) ve kamera dizisi mesafelerine dayalı olarak yoğunluğu ve OT görüntülerini hesaplayabilir.
Belirli bir sıcaklık profilini elde etmek amacıyla SLM'ye uygulanan faz modelini hesaplamak için, aşağıdaki genel depoda bulunan önceden geliştirilmiş ev yapımı bir algoritmayı39,42 kullandık: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Giriş, dijital olarak veya tek renkli bir bmp görüntüsü aracılığıyla ayarlanabilen istenen sıcaklık alanıdır.
Hücreleri bölümlere ayırmak ve kuru ağırlıklarını ölçmek için aşağıdaki halka açık depoda yayınlanan Matlab algoritmamızı kullandık: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Kullanıcının her görüntüde ilgilenilen bakteriye veya mCFU'ya tıklaması, çubuk hassasiyetini ayarlaması ve seçimi onaylaması gerekir.
Çalışma tasarımı hakkında daha fazla bilgi için bu makaleyle bağlantılı Doğa Araştırma Raporu özetine bakın.
Bu çalışmanın sonuçlarını destekleyen veriler, makul talep üzerine ilgili yazarlardan temin edilebilir.
Bu çalışmada kullanılan kaynak kodu Yöntemler bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve hata ayıklama sürümleri https://github.com/baffou/ adresinden şu depolardan indirilebilir: SLM_temperatureShaping, CGMprocess ve CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillere ve bunların geniş spektrumlu uygulamalarına bakış. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillere ve bunların geniş spektrumlu uygulamalarına bakış.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ve Sharma, AK Termofillere ve geniş uygulamalarına genel bakış. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ve Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ve Sharma AK Termofillere ilişkin derin bir anlayış ve geniş bir uygulama yelpazesi.3 Biyoteknoloji 6, 81 (2016).
Gönderim zamanı: 26 Eylül 2022